Cytoplasmic linker protein 170 inhibits papillary thyroid cancer cell metastasis through the TGF-β pathway
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摘要:目的
研究细胞质连接蛋白170（cytoplasmic linker protein 170，CLIP170）是否影响甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）细胞的转移和侵袭并阐明其机制。
方法通过GEO和TCGA数据分析CLIP170在PTC中的表达水平；通过慢病毒转染技术构建CLIP170敲减细胞，Transwell转移和侵袭实验评估其功能；通过免疫荧光观察CLIP170对细胞肌动蛋白结构的影响；以ELISA方法检测细胞培养基中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）1的释放；通过免疫印迹和实时定量荧光PCR方法检测上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和TGF-β信号通路分子的表达量并最终在裸鼠肺转移模型中验证。
结果CLIP170在PTC中的表达量比在正常甲状腺组织中的表达量低。功能方面，CLIP170KD在体外和体内均显著增强了PTC细胞的转移；机制方面，CLIP170KD触发了TGF-β通路的激活，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。TGF-β的抑制剂有效抑制了TGF-β活性，并显著逆转CLIP170KD所诱导的肿瘤转移。
结论CLIP170有望成为一种缓解有转移倾向的PTC的治疗靶点。
Abstract:ObjectiveTo explore whether cytoplasmic linker protein 170 (CLIP170) affects papillary thyroid cancer (PTC) cell metastasis and invasion and clarify the underlying mechanisms.
MethodsWe analyzed CLIP170 expression levels in PTC using GEO and TCGA data and constructed CLIP170 knockdown (CLIP170KD) cells using lentiviral transfection. Then, we evaluated their functions through Transwell transfer and invasion assays. We assessed how CLIP170 affected the cellular actin structure via immunofluorescence analysis. We detected transforming growth factor-β 1 (TGF-β1) release in the cell culture medium using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). We also assessed epithelial-mesenchymal transition (EMT) and TGF-β signaling pathway molecule expression using immunoblotting and reverse-transcription quantitative fluorescence PCR and validated the results in a nude mouse lung metastasis model.
ResultsCLIP170 expression level in PTC was lower than that in normal thyroid tissue. Regarding the function, CLIP170KD significantly enhanced PTC cell metastasis both in vitro and in vivo. Regarding the underlying mechanism, CLIP170KD triggered TGF-β pathway activation, subsequently promoted tumor cell migration and invasion. The inhibitor of TGF-β effectively inhibited TGF-β activation, and this inhibition significantly reversed the CLIP170KD-induced tumor metastasis.
ConclusionsCLIP170 could be a promising therapeutic target to mitigate metastatic tendencies in PTC.
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甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）占甲状腺癌的主导地位，也是甲状腺癌发病率激增的主要原因[1-2]。尽管高复发率并非PTC患者的主要死亡原因，但显著影响了患者的总体生存率[3]。值得注意的是，复发风险与肿瘤细胞的转移密切相关[4]。因此，寻找能够阻碍转移的分子靶点，对于治疗PTC至关重要。CLIP170作为一种微管正末端示踪蛋白（+TIP），可以结合并稳定微管正末端，对细胞膜突起的形成具有调节作用[5]，提示其在肿瘤细胞转移中的潜能。尽管已有研究揭示了CLIP170在肿瘤恶性进展中的作用[6-7]，但其对PTC转移的影响仍是未知领域。本研究组前期对含有77例PTC患者的34个家系进行调查，发现有2个家系中CLIP170基因发生突变[8]。通过TCGA数据发现与癌旁组织相比，PTC中CLIP170拷贝数缺失变异更为普遍，且相较于邻近非肿瘤组织，CLIP170在肿瘤组织中的表达量降低，说明CLIP170基因在PTC中可能作为一种抑癌基因而存在。因此，本研究旨在探讨CLIP170对PTC转移的影响，以期为有转移倾向的PTC患者寻找有效的治疗靶点。
1. 材料与方法
1.1 材料
从TCGA和GEO数据库下载PTC的标准化基因表达数据，共分析510个PTC样本和653个正常甲状腺样本的RNA测序数据。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与转染
PTC细胞系TPC-1和BCPAP细胞用RPMI 1640培养基（Gibco，北京擎科生物公司）培养，HEK293T细胞用DMEM培养基（Gibco，北京擎科生物公司）培养。所有完全培养基均在基础培养基中添加10%的胎牛血清并按1 000∶1的比例加入1 000×的环丙沙星原液。细胞培养在含37℃、5%CO2、95%O2的培养箱中。根据说明书，使用Lipofectamine 8000（Beyotime Biotechnology，上海碧云天生物公司）执行质粒DNA转染。所有用于敲低的shRNA序列均参考Sigma官网验证的敲低效率序列，核酸片段由西安市擎科生物公司合成。
1.2.2 Transwell实验
将2×105/孔（迁移）和3×105/孔（侵袭）细胞接种入Transwell小室，下室加入含10% FBS的完全培养基600 μL，上室加无血清基础培养基200 μL。孵育48 h后，用PBS洗3次。用甲醇固定20 min后再用PBS洗3次，最后用结晶紫染色并计数。
1.2.3 酶联免疫吸附实验
人TGF-β1 ELISA试剂盒购自武汉爱博泰克生物公司（ABclonal，RK0055）。实验按照制造商说明书进行。
1.2.4 实时荧光定量PCR
使用Trizol（Vazyme，南京诺唯赞生物公司）提取细胞总RNA。根据ABscriptⅢ RT Master Mix（ABclonal，武汉爱博泰克生物公司）说明进行反转录。实时qPCR根据Genious 2X SYBRGreen Fast qPCR Mix（ABclonal，武汉爱博泰克生物公司）的说明书进行。
1.2.5 蛋白质提取和Western blot
使用RIPA裂解液（合肥Biosharp公司）按标准程序提取细胞总蛋白。将变形后的蛋白质裂解液通过凝胶电泳分离，后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脱脂奶粉封闭，用一抗在4℃冰箱过夜孵育。然后与相应的二抗孵育。使用ECL化学发光溶液（合肥Biosharp公司）在自动化化学发光成像仪（日本Tanon公司，5200 Multi）上将蛋白印记可视化，Image J软件定量。
1.2.6 免疫荧光检测
将细胞适量接种在玻片上。染色前用PBS清洗，并用4%的多聚甲醛固定20 min。0.3%的Triton X-100/PBS室温处理5 min，然后用10%的山羊血清封闭1 h。与一抗在4℃冰箱过夜孵育。将相应的荧光二抗染色，含DAPI的荧光淬灭封闭液封闭，使用激光共聚焦显微镜观察。
1.2.7 动物实验
4～5周龄的雌性小鼠（购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司）于SPF级实验动物中心饲养。将稳定表达shCLIP170的TPC-1细胞和对照组TPC-1细胞分别通过尾静脉注射给裸鼠（每组3只），每只小鼠1×106细胞/100 μL，建立转移模型。注射后8周，收集肺脏，用PBS清洗并用4%的甲醛固定。固定的肺组织包埋在石蜡中，切片，H&E染色并用光学显微镜观察拍照。所有动物实验经过本院动物伦理委员会批准（编号：22021A-544）。
1.3 统计学分析
使用GraphPad Prism 9软件完成实验数据的分析和绘图。所有数据以（
$\bar {x}\pm s $ ）表示，通过非配对t检验确定统计显著性。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 PTC中CLIP170表达水平验证及敲降细胞系构建
在4个GEO数据集共108对样本的分析中，发现CLIP170在PTC中的表达水平均低于相邻癌旁组织（图1A～1D）；TCGA数据中有同样的现象（图1E）。上述结果表明，较低的CLIP170表达水平与PTC进展之间可能存在潜在关联。因此为了研究CLIP170在甲状腺癌中的生物学功能，在PTC细胞系TPC-1和BCPAP中分别构建CLIP170的稳定敲减株（图1F，1G）。
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图 1 CLIP170在甲状腺癌中的表达A～D：GEO数据库GSE29265、GSE33630、GSE53072和GSE65144数据集中CLIP170的表达差异；E：TCGA数据库中CLIP170的表达差异；F，G：TPC-1和BCPAP细胞中，CLIP170在蛋白质和RNA水平的敲降效率；**：P<0.01，****：P<0.000 12.2 CLIP170敲降促进PTC转移和细胞的EMT
Transwell转移和侵袭实验表明，CLIP170KD显著促进了PTC细胞的迁移和侵袭能力（图2A，2B）。
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图 2 CLIP170对PTC细胞的转移和EMT的作用A，B：Transwell实验评估CLIP170敲降后的迁移和侵袭；C，D：CLIP170KD导致EMT标记的改变；E：免疫荧光检测CLIP170基因敲降后的F-actin；F：NC和CLIP170KD的TPC-1细胞在裸鼠肺中的转移灶；G：裸鼠肺组织中转移灶的H&E染色；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 1免疫印记结果显示，CLIP170KD PTC细胞中EMT的重要标志物E-cadherin的表达显著降低，而N-cadherin和Vimentin的表达显著增加，说明CLIP170KD可能促进了PTC细胞的EMT（图2C，2D）。免疫荧光实验发现细胞骨架的主要成分F-肌动蛋白（F-actin）在CLIP170KDTPC-1细胞的皮层区域显著积聚并形成向外的突起（图2E）。
通过尾静脉注射建立裸鼠的细胞转移模型，发现CLIP170KD裸鼠的肺脏与对照组小鼠有显著性差异（图2F）。H&E染色显示，对照组小鼠的肺组织无明显异常，而CLIP170KD裸鼠的肺部形成了PTC细胞的转移灶（图2G），说明CLIP170KD在体内仍能促进PTC的转移。
2.3 CLIP170敲低促进PTC细胞的TGF-β通路激活
为了研究CLIP170KD导致肿瘤细胞转移和EMT的机制，检测了与转移和EMT密切相关的信号通路TGF-β的状态。EILSA实验结果显示，与对照组（NC）相比，CLIP170KD细胞中TGFβ1分泌显著增加（图3A，3B），表明CLIP170KD促进了PTC细胞中TGFβ1的表达，提示CLIP170KD可能激活了TGF-β信号通路。免疫印迹结果表明，TGF-β通路的关键分子Smad2/3和Erk1/2的磷酸化水平在CLIP170KD的PTC细胞中显著增加（图3C，3D）。上述结果表明，CLIP170KD激活了PTC细胞中的TGF-β通路。
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图 3 CLIP170KD调控PTC细胞中TGF-β通路的激活A，B：EILSA 实验检测NC和CLIP170KD的TPC-1和BCPAP细胞培养物中TGFβ1的水平；C，D：CLIP170基因敲降后Smad2/3和Erk1/2磷酸化的免疫印迹及分析统计；**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 12.4 TGF-β抑制剂可逆转CLIP170敲低引起的PTC细胞转移
为了验证TGF-β在PTC转移中的作用，使用TGF-β通路抑制剂（LY2157299）研究对TGF-β的功能依赖性。结果显示，与NC细胞相比，Smad2/3和Erk1/2的磷酸化水平在CLIP170KD的细胞中升高，但在添加抑制剂LY2157299后恢复（图4A，4B），这表明LY2157299成功抑制了CLIP170KD诱导的TGF-β信号通路的激活。然后验证了CLIP170KD介导的TGF-β信号通路的激活对PTC细胞转移的影响。Transwell实验的结果显示，CLIP170KD细胞的迁移和侵袭能力显著增加；然而，在添加LY2157299后这种现象有所恢复（图4C～4F），说明CLIP170KD促进PTC的转移依赖TGF-β通路的激活。
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图 4 TGF-β抑制剂挽救了CLIP170敲降诱导的PTC细胞转移A，B：免疫印迹检测加入TGF-β抑制剂后CLIP170KD诱导的Smad2/3和Erk1/2磷酸化水平；C，D：加入TGF-β抑制剂后的Transwell试验；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 13. 讨论
甲状腺癌是起源于滤泡上皮细胞的恶性肿瘤，而PTC是其中一种预后相对较好的类型[9]。尽管PTC发病机制的研究取得了进展，但PTC患者因转移而导致的高复发率仍然困扰着临床工作者；因此，寻找与肿瘤细胞转移相关的致病因素仍然迫在眉睫。先前的研究发现，CLIP170通过微管依赖机制调节癌症化疗敏感性[10]。然而，有研究发现其与胰腺、乳腺等肿瘤的内皮细胞迁移和侵袭相关[5，7，11]。本研究结果与上述研究一致，证明CLIP170也影响PTC细胞在体内外的转移。
EMT赋予肿瘤细胞转移潜能，经历EMT的细胞会发生细胞骨架重组和表达特性的变化，即上皮细胞连接被破坏，上皮细胞的肌动蛋白发生结构重塑，并从皮层转移至细胞的前端，形成板状伪足、丝状伪足和细胞囊腔，从而促进细胞迁移[12]。而作为细胞骨架重组的基础，F-actin在介导细胞迁移中发挥着关键作用[13]。已有研究显示，CLIP170与肌动蛋白的直接结合可能会破坏细胞外围的微管的稳定性，可能不利于细胞迁移[14]。同样本研究发现，CLIP170的敲减促进了细胞皮质中F-actin的积聚和向外定向的肌动蛋白突起的形成，即CLIP170在PTC中可能作为细胞迁移的负向调节因子而存在。研究发现尽管大多数+TIPs通常促进细胞迁移，但仍存在某些+TIPs反而抑制细胞外基质的降解或阻止侵袭足的形成[5，15]，上述研究为后期提供了另一种思路。此外，尽管本研究中，肌动蛋白突起尚未形成伪足，但其可能是伪足形成的中间状态。本研究推测CLIP170可能与其他+TIPs协同作用于细胞伪足的形成，但仍需进一步研究。
TGF-β信号是各种癌症转移的关键驱动因素。因此，本研究假设PTC中TGF-β的激活可能是CLIP170KD诱导PTC细胞迁移的原因。结果证实了这一假设，TGF-β通路的抑制恢复了CLIP170KD诱导的表型。此外，研究发现TGF-β的激活促进了肌动蛋白细胞骨架的重组[16]。因此，这也解释了CLIP170KD促进肌动蛋白突起形成的现象，并证实了CLIP170在PTC细胞转移中的作用。
总之，本研究说明在PTC细胞中，当CLIP170被敲除时，TGF-β通路激活，从而促进细胞转移和EMT。然而，目前尚未明确TGF-β激活是否参与PTC细胞中肌动蛋白骨架的重排和膜片伪足的形成，以及其他+TIPs是否参与了CLIP170促进膜突形成。本研究展示了CLIP170-TGF-β轴在PTC细胞转移中的重要性，为未来的研究提供了一个关键的研究方向。
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图 1 CLIP170在甲状腺癌中的表达
A～D：GEO数据库GSE29265、GSE33630、GSE53072和GSE65144数据集中CLIP170的表达差异；E：TCGA数据库中CLIP170的表达差异；F，G：TPC-1和BCPAP细胞中，CLIP170在蛋白质和RNA水平的敲降效率；**：P<0.01，****：P<0.000 1
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图 2 CLIP170对PTC细胞的转移和EMT的作用
A，B：Transwell实验评估CLIP170敲降后的迁移和侵袭；C，D：CLIP170KD导致EMT标记的改变；E：免疫荧光检测CLIP170基因敲降后的F-actin；F：NC和CLIP170KD的TPC-1细胞在裸鼠肺中的转移灶；G：裸鼠肺组织中转移灶的H&E染色；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 1
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图 3 CLIP170KD调控PTC细胞中TGF-β通路的激活
A，B：EILSA 实验检测NC和CLIP170KD的TPC-1和BCPAP细胞培养物中TGFβ1的水平；C，D：CLIP170基因敲降后Smad2/3和Erk1/2磷酸化的免疫印迹及分析统计；**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 1
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