胃癌居全球癌症发病谱及死因谱的第5位，导致患者较大的疾病负担^[1]。Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV）阳性胃癌约占胃癌病例总数的2%～20%^[2]，具有独特的分子和临床病理特征，针对EBV阳性胃癌的免疫治疗已取得积极疗效。1990年，Burke等^[3]基于胃淋巴上皮瘤样癌（lymphoepithelioma-like carcinoma，LELC）石蜡包埋样品，首次证明LELC组织中可能存在EBV感染。1993年，Tokunaga等^[4]通过原位杂交技术证实胃癌细胞中存在EBV编码的小RNA（EBV-encoded small RNAs，EBERs）。2014年，癌症基因组图谱（TCGA）根据分子特征将胃癌分为4种分子病理亚型，并发现EBV阳性者具有PIK3CA突变、DNA高甲基化以及程序性死亡蛋白配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）/程序性死亡蛋白配体2（programmed death-ligand 2，PD-L2）过表达扩增等独特的分子特征^[5]。系统综述和Meta分析表明，EBV阳性胃癌好发于年轻患者，男性发病率约为女性的2～3倍，多位于近端胃或残胃近端区域，弥漫型多于肠型，其中LELC中EBV阳性率高达80%，患者通常具有良好的预后水平及免疫治疗疗效^[6-7]。

鉴于胃癌病因学的复杂性以及EBV阳性胃癌独特的分子和临床病理特征，越来越多研究探讨个体EBV感染与胃癌发生发展的关系及其潜在作用机制。本文针对相关研究进展进行综述，以期为进一步明确EBV感染与胃癌发生发展的关系提供借鉴。

1.   EBV感染与胃癌的关联研究进展

目前，探讨EBV感染与胃癌关联的流行病学研究中常用的EBV感染检测手段包括：EBERs原位杂交（EBER-ISH）检测、EBV核酸（EBV-DNA）载量检测及EBV特异性抗体检测等。EBV感染胃上皮细胞是EBV阳性胃癌形成的关键步骤，利用EBER-ISH检测能够精准定位EBV感染的细胞类型，而EBV-DNA载量及EBV特异性抗体检测仅能体现个体EBV感染情况，无法判断细胞内EBV感染情况，灵敏度较高但特异度较低^[8-9]。

1.1   EBER-ISH检测作为EBV感染指标的流行病学研究

20世纪90年代，EBER-ISH检测技术被引入病理学领域，可用于识别组织切片上EBV感染的细胞。EBERs大量存在于EBV潜伏感染细胞中，可在福尔马林固定和石蜡包埋的组织样本中稳定检出，通过检测胃癌组织中EBERs能够定位到EBV感染的胃上皮细胞，是目前公认可诊断EBV阳性胃癌的金标准^[10]。Tokunaga等^[4]通过对胃癌组织和邻近胃组织石蜡切片进行EBER-ISH检测发现，几乎所有淋巴间质型胃癌均为EBV阳性，EBV阳性胃癌患者中几乎所有胃癌细胞均存在EBERs，而癌旁组织中无EBERs检出。一项对235例胃癌组织样本EBER-ISH检测的研究表明，EBERs仅存在于胃癌细胞中，且原发性胃癌及转移性胃癌的所有淋巴结中的胃癌细胞中均可检测到EBERs，提示EBV与胃癌细胞同时进行复制，EBV感染可能发生于胃癌早期阶段^[11]。Chen等^[9]通过对25个经EBER-ISH检测明确为EBERs阳性的胃癌患者进行分析发现，在同一患者的重度不典型增生（high-grade dysplasia，HD）上皮细胞中同样可检出EBERs，而在正常胃黏膜和轻度不典型增生（low-grade dysplasia，LD）组织中，仅有有限的EBERs来自少数受感染的B细胞，表明EBV广泛感染可能发生于侵袭前阶段，且与侵入胃上皮细胞有关。目前，尚缺乏针对胃黏膜病变进展和胃癌发生的多阶段过程，基于大样本分子流行病学研究探讨EBV感染潜在作用的研究证据。

1.2   EBV-DNA载量作为EBV感染指标的流行病学研究

EBV-DNA载量已被证明可作为EBV相关恶性肿瘤的诊断和预后指标，如鼻咽癌^[12]，然而目前对于EBV-DNA载量与胃癌发生风险和预后关联的流行病学研究仍较少。Shoda等^[13]评估了血浆EBV-DNA载量在EBV阳性胃癌中的临床应用，发现血浆EBV-DNA载量检测EBV阳性胃癌的敏感性和特异性分别为71.4%和97.1%，血浆EBV-DNA载量在EBV阳性胃癌患者治疗后减少，而在肿瘤进展/复发期间增加。一项针对2 760例胃癌患者（包括140例EBER-ISH检测验证的EBV阳性胃癌患者）的前瞻性研究得到了一致的结果，EBV阳性胃癌患者的血浆EBV-DNA载量在接受胃切除术和化疗后降低，而在复发过程中增加，血浆EBV-DNA载量可作为EBV阳性胃癌复发和化疗敏感性的良好标志^[14]，证实EBV在胃癌进展中的作用。此外，Sarshari等^[15]定量分析了胃癌患者血浆和胃活检组织中EBV-DNA载量，发现EBV阳性胃癌患者血浆和胃活检组织中EBV-DNA载量均显著高于EBV阴性胃癌患者，其中胃活检组织中具有显著性差异（P<0.001）。

1.3   EBV特异性抗体作为EBV感染指标的流行病学研究

机体感染EBV后，体内受感染的宿主细胞表达出不同的病毒抗原并产生相应的抗原特异性抗体，这些特异性抗体可反映EBV感染阶段和宿主免疫反应水平。其中，病毒衣壳抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）和EBV核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA）的IgG抗体及IgA抗体是EBV感染相关肿瘤研究中常用的抗体^[16]。两项病例对照研究表明，胃癌患者VCA-IgA和EA-IgG的血清阳性率高于健康对照组，两种指标均与胃癌风险呈正向关联^[17-18]。同时，一项巢式病例对照研究结果显示，血清EBNA1-IgA和VCA-IgA的相对光密度值增加均与胃癌风险升高显著相关，年龄调整后的OR分别为1.99（95%CI：1.07～3.70）和2.64（95%CI：1.33～5.23）^[19]。然而在另一项病例对照研究中，4种EBV特异性抗体血清阳性率均未观察到与胃癌风险的显著关联^[20]。此外，两项队列研究表明EBV特异性抗体水平与胃癌癌前病变的进展存在关联。Schetter等^[21]通过随访不同胃黏膜病变程度的受试者的血清抗体水平发现，在随访期间VCA-IgG和EBNA-IgG的血清几何平均滴度随胃黏膜病变的进展显著升高，这一关联对基线诊断为肠化生的受试者更为明显（肠化生组：VCA-IgG：OR=3.8，95%CI：1.0～15.0；EBNA-IgG：OR=5.7，95%CI：1.6～20.0）。Wang等^[22]发现血清VCA-IgG水平与萎缩性胃炎和胃癌风险升高显著相关，分别使患者发生萎缩性胃炎和胃癌的风险增加1.36倍和1.55倍。研究还发现在肠型胃癌中，血清VCA-IgG阳性患者的生存率低于血清VCA-IgG阴性患者（HR=2.45，95%CI：1.04～5.78）。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）诱导的胃黏膜慢性炎症是胃癌的主要危险因素。既往病例对照研究通过抗体和抗体水平表明，EBV感染可能也是胃癌癌前病变的独立危险因素，而血清EBV和Hp合并感染与胃癌癌前病变风险升高显著相关（OR=8.4，95%CI：1.8～38.9）^[23]。上述研究证据提示EBV感染可能在胃黏膜病变阶段发挥作用，但EBV与Hp合并感染在胃黏膜病变和胃癌进展中是否具有协同作用及其潜在作用机制尚需进一步研究。

2.   EBV潜伏期基因及蛋白产物在胃癌发生发展中的作用

EBV通过口腔途径进行原发性感染后建立一种终身的病毒载体状态，称为潜伏感染，可组成性地表达一组有限的潜伏基因及蛋白产物，包括EBNAs、潜伏膜蛋白（latent membrane proteins，LMPs）、EBERs以及来自BamHI-A右向转录物的40个miRNA（BART miRNAs）等。根据EBV潜伏期基因及蛋白产物的不同组合，可分为4种潜伏模式：潜伏0、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。潜伏0型仅表达EBERs和BARTs，常见于在静止记忆B细胞中，此类感染者多为健康人群；潜伏Ⅰ型表达EBNA1、EBERs和BARTs，多见于B细胞中，如Burkitt's淋巴瘤；潜伏Ⅱ型表达EBNA1、LMP1、LMP2、EBERs和BARTs，可见于B细胞和上皮细胞中，如鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤；潜伏Ⅲ型表达EBNAs（EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA-LP）、LMPs（LMP1、LMP2）、EBERs（EBER1、EBER2）和BARTs，可见于B细胞中，如移植后淋巴瘤。而EBV阳性胃癌表现为介于潜伏Ⅰ型和Ⅱ型之间的独特类型，表达EBNA1、LMP2A、EBERs和BARTs等，而无LMP1表达^[24]。

2.1   EBNA1

EBNA1是一种序列特异性DNA结合蛋白，可与EBV复制的潜在起源（OriP）及宿主染色体结合，对宿主基因组的调控至关重要^[25]。Lu等^[26]研究发现，EBNA1可与胃癌细胞中胃癌特异性抑癌基因胃动蛋白1（gastrokine 1，GKN1）和GKN2的不同启动子结合，导致GKN1与GKN2的复杂转录和表观遗传学失调。此外，EBNA1可通过促进基因组不稳定性的方式改变细胞环境，从而促进肿瘤发生。Kim等^[27]通过建立稳定表达EBNA1的细胞系发现，EBNA1可上调NADPH氧化酶2表达并促进活性氧产生，参与DNA损伤反应，进而提高胃癌细胞存活率。

2.2   LMP2A

LMP2A是EBV编码的潜伏膜蛋白，可增强细胞侵袭与转移能力，诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）^[28]。Pal等^[29]发现LMP2A介导Notch通路导致胃癌细胞中动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）升高，可诱导线粒体分裂及EMT标志物过表达，从而促进细胞迁移与侵袭。同时，LMP2A具有N端细胞质结构域，该结构域包含多个信号结构域，有助于调节信号通路。Li等^[30]研究表明，LMP2A可促进信号转导和转录活化蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化，引起EBV感染的胃癌细胞ETS同源因子（ETS homologous factor，EHF）表达升高，促进增强子激活和细胞增殖。此外，LMP2A还可通过MAPK、PI3-K/Akt等通路影响EBV潜伏状态，进而促进肿瘤细胞癌变^[31]。

2.3   EBERs

EBERs是EBV潜伏感染细胞中表达最丰富的双链非编码RNA，包括EBER1和EBER2，可促进细胞生长增殖并调节EBV相关肿瘤的先天免疫^[24]。EBERs的双链RNA结构使其能够与Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）相互作用，并诱导下游效应分子胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）表达。既往研究表明，IGF-1在EBV阳性胃癌细胞中持续表达，促进胃癌细胞的自分泌生长^[32]。同时，EBERs可促进抗病毒和抗增殖细胞因子产生，如通过阻断干扰素（interferons，IFNs）诱导的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，使受感染的细胞免受IFNs诱导的抗病毒反应，促进肿瘤的发生发展^[33]。

2.4   BARTs

BARTs是EBV基因组BamHI-A右向转录本，可编码22个miRNA前体和40个成熟miRNA。BART miRNAs主要在上皮细胞中表达，约占EBV阳性胃癌细胞总miRNA的15%，在调节细胞增殖与转移和EBV及宿主基因表达等方面发挥重要作用^[34]。近期有研究^[35]报道BART miRNAs在胃癌细胞中发挥的作用及作用机制。其中，EBV-miR-BART5-3p是首个被鉴定为抑制抑癌基因TP53表达和功能的EBV编码miRNA，可通过直接靶向TP53的3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR），下调TP53表达，加速细胞周期进程并抑制细胞凋亡，从而促进胃癌进展^[36]。此外，BART miRNAs在诱导甲基化、调控EMT及免疫应答等过程中也发挥着潜在作用，具体机制仍需进一步探索。

3.   EBV诱导表观遗传异常在胃癌发生发展中的作用

DNA甲基化是表观遗传的一种重要机制，通过调控某些组织特异性基因活性，在肿瘤发生中起作用。TCGA对近300例胃癌患者进行的全甲基化组分析显示，EBV阳性胃癌表现出极端的CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP），导致约19%的启动子CpG岛甲基化^[5]。Matsusaka等^[37]通过诱导正常胃细胞感染EBV发现，EBV感染可使胃上皮细胞获得EBV阳性胃癌的表观基因型，直接诱导宿主全基因组甲基化，该研究进一步通过焦磷酸测序发现EBV基因组甲基化先于宿主基因组，提示EBV诱导甲基化的有序机制。既往研究表明，EBV诱导的高甲基化可能与LMP2A上调DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）表达及下调关键脱甲基酶TET1和TET2表达有关。同时，EBV诱导的宿主基因高甲基化可导致抑癌基因表达水平下调，包括APC、PTEN、CDKN2A（p14/p16）、CDKN2B（p15）和DAPK等^[38]。然而宿主基因组甲基化并不是导致EBV感染的胃上皮细胞中宿主基因表达整体变化的唯一表观遗传学机制，Okabe等^[39]通过对胃细胞系进行三维染色质拓扑结构的全基因组分析发现，EBV可能通过“增强子侵染（enhancer infestation）”的重编程途径直接改变宿主表观遗传景观，促进原癌基因激活和胃癌发生。研究者发现即使消除EBV基因组，其诱导的表观遗传修饰仍持续存在。

4.   结语与展望

随着现代分子生物学各种新技术手段的发展，胃癌的不同分子亚型及内在机制受到广泛关注与讨论。EBV阳性胃癌是胃癌的一类少见分子亚型，具有独特的分子和临床病理特征。EBV感染胃上皮细胞后表达潜伏期基因及蛋白产物，诱导宿主基因突变及表观遗传异常，进而促进胃癌发生发展。然而现有研究多局限于体外细胞实验和小样本的病例对照研究，EBV感染是否为Hp之外胃癌的关键致病因素仍需进一步探索。鉴于胃癌病因和病程演进的复杂性，未来仍需依托大样本长期多点前瞻性随访队列开展研究，厘清EBV感染与长期随访过程中胃癌，特别是Hp阴性胃癌发生风险的潜在关联，以及探讨Hp与EBV感染的潜在交互作用，对进一步阐明胃癌病因学和胃癌防控至关重要。

EBV阳性胃癌患者预后较好，可从免疫治疗中获益，识别EBV阳性胃癌高危人群及早筛早诊对临床胃癌的精准化诊疗具有重要意义。目前，EBV阳性胃癌的诊断依赖于对病理组织EBERs原位杂交，由于EBV阳性胃癌较低的发病频率，应用该方法进行广泛检测的成本效益不佳，而现有基于血液学的EBV特异性检测方法很难反映出胃上皮细胞的感染程度，结果用于预测胃癌发生风险或诊断胃癌的能力存疑，因此亟需探索EBV阳性胃癌的潜在生物标志物，开发更简便有效且低成本的早期诊断方法，以推动精准化胃癌防控策略和诊疗手段的开展与实施。