肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第三大恶性肿瘤，其发病率高，且就诊时多数已属中晚期，预后较差，目前仍无特异性的治疗手段^[1]。因此探寻可应用于早期诊断及靶向治疗的关键分子，并由此探讨肝癌发生发展的机制已成为当前肝癌研究热点。近年提出的跨种属肿瘤基因组学策略（cross-species oncogenomic approach）被认为是筛选和鉴定关键肿瘤基因的有力工具^[2]。本研究前期通过基因组富集以及Meta分析的方法，从5套不同种属的肝癌基因表达芯片中成功筛选出MCM7等多个在转录水平发生改变的基因^[3]。MCM7作为细胞周期的复制准许因子，对细胞增殖起重要的调节作用。研究表明，MCM7蛋白在包括肝癌的多种肿瘤中呈高表达^[4]。目前，国内外尚无跨种属策略应用于MCM7与肝癌关系研究的相关报道。本研究旨在通过Western blot和免疫组化技术检测MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩3个种属的肝癌、相应癌旁及正常肝组织的表达水平，从而深入探讨MCM7蛋白在肝癌发生发展过程中的作用及意义。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   实验标本收集

17例肝癌及其癌旁肝组织和5例正常肝组织为广西医科大学附属肿瘤医院2009年1月至2010年9月经手术切除后保存，肝癌患者术前均无放疗化疗史，正常肝组织来源于肝良性占位病变经手术切除者。大鼠12例肝癌及其癌旁组织和3例正常肝组织、树鼩4例肝癌及其癌旁组织和3例正常肝组织均为本课题组前期项目所保存^[5-6]，其中大鼠和树鼩肝癌模型均为黄曲霉毒素B1所诱发。所有组织在手术切除后先经液氮速冻然后转移到-80℃，各组织类型标本均经病理组织学检查证实。

1.1.2   免疫组化实验标本

29例人肝癌及癌旁肝组织、10例正常肝组织石蜡包埋标本来自广西医科大学附属肿瘤医院病理科2006年6月至2010年5月存档标本，所有肝癌病例均为未经放化疗的原发病例，并按2001年第八届全国肝癌学术会议提出的肝癌标准进行分期，其中Ⅰ~Ⅱ期16例，Ⅲ期13例。正常肝组织10例来源于肝良性占位病变经手术切除者。大鼠10例肝癌及其相应癌旁肝组织和8例正常肝组织、树鼩4例肝癌及其相应癌旁组织和3例正常肝组织石蜡包埋标本均来自本实验室前期实验^[5-6]，其中大鼠和树鼩肝癌模型均为黄曲霉毒素B1所诱发。

1.2   主要试剂与仪器

一抗单克隆兔抗MCM7抗体为Abcam公司的anti-MCM7 antibody[EP1974Y]（ab52489），均适用于人、大鼠及小鼠，并适用于Western blot及免疫组织化学等多项检测；鼠抗GAPDH单克隆抗体购自北京中杉金桥公司，均适用于人和大鼠及小鼠。因树鼩与人的基因组有高度同源性，且其肝脏组织蛋白组表达谱较啮齿类动物大鼠和小鼠更接近于人类^[7]，故本实验适用于人的抗体亦适用于树鼩。Dylight680荧光标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗购自美国KPL公司。红外荧光成像仪Odyssey为美国LI-COR公司产品。DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.3   方法

1.3.1   Western blot检测

分别取各例组织样本50~ 100 mg常规方法提取总蛋白，加入上样缓冲液煮沸变性，加样至SDS-PAGE胶上电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜；加一抗（MCM7工作液浓度1：2 000，GAPDH工作液浓度1：1 000），过夜孵育，洗膜；加荧光二抗（工作液浓度1：7 500），室温避光孵育1 h，洗膜；以Odyssey红外荧光成像仪扫描图像，读取灰度值。MCM7蛋白相对表达量=MCM7条带灰度值/ GAPDH条带灰度值。

1.3.2   免疫组织化学染色及结果判定

取各蜡块分别4 μm连续切片，常规脱蜡处理。实验过程采用SP法常规操作，兼Լ抗MCM7单克隆抗体1：200稀释，DAB显色，苏木素复染。每批染色均设已知阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（phosphatic buffered saline，PBS）代替一抗作阴性对照。结果判定：MCM7蛋白以细胞核中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性显色。每个标本首先在低倍视野（×100）下浏览切片，选择组织结构良好、背景清晰的5个阳性细胞最密集区域，高倍视野（×400）下观察计数视野内细胞总数及阳性细胞数，按公式求出每例的MCM7阳性标记指数（labelling index，LI），LI=阳性细胞总数/细胞总数× 100%。设定阳性细胞数 < 10%为（-），10%~30%为（+），30%~70%为（++），>70%为（+++）。以（-）为表达阴性，以（+）~（+++）为表达阳性。

1.4   统计学分析

采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析处理，Western blot结果中各组计量资料数据用x±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），免疫组织化学阳性率的比较采用χ²检验或Fisher精确检验，临床病理特征数据采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Western blot检测结果

人和大鼠肝癌组织MCM7蛋白的表达水平均显著高于其癌旁及正常肝组织（P < 0.05）；树鼩肝癌组织MCM7蛋白的表达高于癌旁及正常肝组织，但差异无显著性意义（P>0.05）；3种属癌旁与正常肝组织比较，MCM7蛋白表达水平差别均无统计学意义（P>0.05，图 1~4）。

图  1  Western blot检测MCM7蛋白在人肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达

Figure  1.  Western blot analysis of MCM7 protein levels in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of human

1, 3:HCC tissues; 2, 4:Peritumoral tissues; 5, 6:Nomal liver tissues

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图  2  Western blot检测MCM7蛋白在大鼠肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达

Figure  2.  Western blot analysis of MCM7 protein levels in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of rat

1, 3:HCC tissues; 2, 4:Peritumoral tissues; 5, 6:Nomal liver tissues

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图  3  Western blot检测MCM7蛋白在树鼩肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达

Figure  3.  Western blot analysis of MCM7 protein levels in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of tree shrew

1, 3:HCC tissues; 2, 4:Peritumoral tissues; 5, 6:Nomal liver tissues

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图  4  MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩的肝癌、癌旁及正常肝组织中的相对表达（x±s）

Figure  4.  Expression of MCM7 protein in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues in three species including human, rat and tree shrew

△Compared with HCC tissues P < 0.01;*Compared with HCC tissues P < 0.05

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2.2   免疫组化检测结果

MCM7蛋白主要在细胞核中表达，少许在细胞质中表达，呈黄色或棕黄色颗粒状染色，在肝癌组织中多数为阳性表达，而在癌旁及正常肝组织中主要为阴性或弱阳性表达（图 5）。统计结果显示，在人肝癌及对应癌旁肝组织中MCM7蛋白阳性率分别为93.1%（27/29）和37.9%（11/29），在正常肝组织中，其阳性率为20.0%（2/10）；在大鼠肝癌及对应癌旁肝组织中MCM7蛋白阳性率分别为100%（10/10）和30.0%（3/10），在8例正常肝组织中，MCM7蛋白表达阴性；在树鼩肝癌组织中MCM7蛋白阳性率为100%（4/4），在4例癌旁肝组织及3例正常肝组织中，MCM7蛋白表达均为阴性。人、大鼠、树鼩的肝癌组织分别与癌旁、正常肝组织MCM7蛋白阳性率比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），而癌旁与正常肝组织相比，差异无统计学意义（P均>0.05）。

图  5  免疫组织化学染色法检测MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩肝组织中的表达情况（SP×400）

Figure  5.  Expression of MCM7 proteins in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew(SP×400)

A，D，G：Expression of MCM7 proteins in HCC tissues；B，E，H：Expression of MCM7 proteins in peritumoral tissues；C，F，I：Expression of MCM7 proteins in normal liver tissues

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2.3   MCM7蛋白的表达与肝癌患者临床病理特征之间的关系

结合免疫组化结果对MCM7蛋白表达与肝癌临床指标的关系进行统计学分析。结果表明，MCM7蛋白的表达与患者性别、年龄、HBV感染、门静脉侵犯、肿瘤数目及大小、分化程度以及AFP表达情况无明显关系，差异均无统计学意义（P>0.05）；而与肿瘤分期、肝外转移以及术后复发有关，差异均有统计学意义（P < 0.05，表 1）。

表  1  MCM7蛋白的表达与肝癌患者临床病理特征之间的关系

Table  1.  Correlation between the expression of MCM7 protein and clinicopathologic characteristics in HCC patients

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3.   讨论

微小染色体维持蛋白（mini-chromosome maintenance proteins，MCM）家族是一类在真核生物广泛存在的高度保守蛋白质，MCM2-7复合物在真核细胞的复制起始和延伸中发挥着重要的作用。MCM7作为MCM复合体成员之一，在启动DNA复制、合成中起关键作用，确保DNA复制在一个细胞周期中只有一次^[8]。MCM7失调可能导致细胞进入异常的增殖周期，诱使肿瘤的发生。最新研究发现MCM7基因组序列中的微小RNA簇可下调P21、E2F1、BIM、PTEN等一些肿瘤抑制因子的表达，且MCM7的致癌潜能及其微小RNA簇已在一些体外实验及动物模型中得以证实^[9]。此外MCM7蛋白还在ITGA7等一些致癌或抑癌信号通道中起着关键分子的作用^[10]，提示MCM7蛋白与肿瘤形成关系极为密切。目前已有大量研究表明，MCM7蛋白在乳腺癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞中均呈高表达，可作为反映癌细胞增殖活性及判断其生物学行为的指标之一^[11-13]。

跨种属肿瘤基因筛选策略是指通过比较不同种属同种肿瘤（无论何种因素致癌）基因表达谱间的相似改变，探寻肿瘤发生发展中的关键分子。目前该策略已应用于多种肿瘤研究，认为在人和动物的肿瘤发生发展过程中，保守存在的共同改变基因可能是诱发或促进肿瘤的关键分子^[14]。前期研究中，采用跨种属策略成功筛选出MCM7等一组肝癌差异表达基因。本实验中应用Western blot及免疫组化技术，从定性、定位及定量等方面同步检测了MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩的肝癌组织、对应癌旁及正常肝组织中的表达情况。Western blot结果表明，MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩3个种属的肝癌组织中均呈高表达，而在相应的癌旁及正常肝组织中MCM7蛋白的表达水平较低。免疫组化进一步验证了Western blot的结果，并显示MCM7蛋白主要表达于肝癌细胞核中，而癌旁及正常肝组织中表达则较少或无表达，此结果与近年研究报道一致^[15-16]。刘娟等^[15]和Zhou等^[16]采用免疫组化染色均发现，MCM7蛋白在人的非癌肝组织中不表达，而在肝癌组织中的阳性表达率较高，但他们并未在其他种属的肝癌中对MCM7蛋白进行检测。

另外本研究结合免疫组化结果分析了MCM7蛋白表达与肝癌患者临床参数的关系。结果显示Ⅲ期肝癌组织中MCM7的表达显著高于Ⅰ~Ⅱ期组织，提示MCM7蛋白表达水平可作为病情进展的一个判断依据；此外MCM7蛋白在有肝外转移肝癌中的表达高于其在无转移肝癌中的表达，提示MCM7蛋白增高可能与肿瘤的转移密切相关；另外MCM7蛋白在术后复发肝癌中的表达高于其在无复发肝癌中的表达，以上均提示MCM7蛋白可作为预后判断的有效指标。本实验未发现MCM7蛋白的表达与患者性别、年龄、HBV感染、门静脉侵犯、肿瘤数目及大小、分化程度以及血清肿瘤标志物AFP等临床指标有相关性。刘娟等^[15]分析表明，MCM7蛋白表达水平与患者的年龄、性别、有无门脉癌栓、癌灶个数及HBsAg阳性与否无关，而与肿瘤直径、包膜完整、肝癌分期及分级相关，除肿瘤直径相关性不一致外，包膜完整性及肝癌分级本研究未做探讨，其他结果基本与实验分析一致；而Zhou等^[16]发现MCM7的表达与肝内转移、血管浸润相关，可作为一个独立的总生存率预测分子，对术后预测具有重要的意义，与本实验结果亦有一致性。本实验在临床病理特征分析中与其他研究者存在不一致的情况，其原因可能为样本例数来源及实验条件不同所致。总之，本实验结果和目前MCM7在肝癌中的研究均表明，MCM7蛋白可作为一个重要的诊断及预后预测分子。

综上所述，本研究证实了MCM7蛋白在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌、癌旁、正常肝组织中的表达差异显著，且发现MCM7蛋白表达与患者肝癌分期、转移及复发相关，说明MCM7有望成为肝癌早期诊断、评价恶性进展及判断预后的有效指标，同时也证明了跨种属研究策略有望寻找和挖掘到肿瘤诊断或治疗的关键分子。本实验是对MCM7蛋白在多种属肝癌中表达水平的初步验证，将今后适度加大样本量进一步研究MCM7在肝癌中的表达及其意义。下一步，将通过体外及体内实验进一步观察MCM7对肝癌细胞生物学行为及肝癌发生发展过程的影响，从而深入探讨MCM7作为防治肝癌靶点的可能性。