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摘要:目的 探讨胃癌中凝血酶敏感素-2（thrombospondin-2，THBS2）基因表达的临床意义及其与患者临床病理特征的关系，分析THBS2基因表达与胃癌组织中微血管密度（MVD）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达水平的相关性。方法 采用实时荧光定量PCR技术检测82例配对的胃癌组织及癌旁组织THBS2 mRNA的表达，并分析其与临床病理特征的关系；应用免疫组织化学Elivision法检测胃癌组织中MMP-2表达情况，通过CD34免疫组织化学染色评价肿瘤组织MVD；分析THBS2 mRNA的表达与MVD、MMP-2表达的相关性。结果 THBS2 mRNA在胃癌中的表达高于癌旁组织（P=0.002）；胃癌组织中THBS2 mRNA的表达水平与肿瘤浸润程度、MVD及MMP-2表达密切相关（P=0.023，r=0.35，P < 0.01，P=0.004），但与性别、年龄、肿物大小、组织分型及淋巴结转移无关（P=0.53，P=0.53，P=0.21，P=0.84，P=0.96）。结论 THBS2可能在胃癌发生和发展中起重要的作用；THBS2可能通过调节MMP-2的表达，促进肿瘤生长与转移，但其确切的作用及机制有待进一步的研究。Abstract:Objective To investigate the clinical significance of thrombospondin-2 (THBS2) mRNA expression in gastric carcinoma and its relationships with clinicopathologic features, microvessel density (MVD), and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2).Methods THBS2 mRNA expression was detected in 82 cases of gastric carcinomas and adjacent tissues using real-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction. The correlation of this expression with clinicopathologic features was also analyzed. Cluster of differentiation 34 (CD34) and MMP-2 protein expression was examined using an immunohistochemical Elivision method. MVD was determined based on CD34-positive tubular structures.Results The THBS2 mRNA expression level was significantly higher in the gastric carcinomas than in paraneoplastic tissues (P=0.002). The expression was associated with the depth of tumor invasion, MVD, and MMP-2 (P=0.02, r= 0.35, P < 0.01, and P=0.004, respectively) but not with patient gender, patient age, tumor size, histological type, and lymph node metastasis (P=0.53, P=0.53, P=0.21, P=0.84, and P=0.96, respectively).Conclusions THBS2 may be significantly involved in the occurrence and progression of gastric carcinoma. The effects of THBS2 on gastric tumor growth and metastasis can be monitored by controlling the MMP-2 expression in the carcinoma. However, the specific functions and underlying mechanisms of THBS2 require further investigation.
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胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居前列。我国胃癌占全球消化道肿瘤发病总数的30%以上，死亡率在世界范围内属于高水平地区[1]。肿瘤的微环境对肿瘤细胞的生长、侵袭及转移等生物学行为有非常重要作用。肿瘤基质中的肿瘤细胞、基质细胞通过分泌各种基质蛋白及生长因子，调控肿瘤细胞的生长、侵袭及转移[2]。THBS2为凝血酶敏感素（thrombospondins，THBS）家族成员之一，由纤维母细胞、平滑肌细胞分泌，人类THBS2 mRNA正常表达于心脏、肌肉、胚胎、免疫细胞及神经组织中。近年来的研究表明，THBS2可在多种肿瘤组织中表达并与肿瘤的发生、发展相关[3-4]，但其在胃癌中的作用，文献报道鲜见。本研究应用Real-time PCR技术检测82例原发性胃癌及癌旁组织中的THBS2 mRNA表达水平，采用免疫组织化学方法检测MMP-2，CD34在胃癌中的表达情况，探讨THBS2 mRNA表达与胃癌临床病理学特征、MVD和MMP-2表达水平的关系，评价其在胃癌发生和发展中的意义。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1收集福建省肿瘤医院及福建医科大学第一附属医院自2006年2月至2007年7月期间胃癌切除标本82例，临床资料完整，全部病例术前均未进行化疗及放疗。其中男性64例，女性18例；年龄38~80岁，中位年龄51.5岁。组织学类型：弥漫型胃癌48例（低分化腺癌39例，黏液腺癌3例，印戒细胞癌5例，未分化癌1例），肠型胃癌34例。根据2010年UICC胃癌TNM分期标准浸润至肌层12例，浸润全层70例，即T1~T2 12例，T3~T4 70例。有淋巴转移63例，无淋巴转移19例。以上实验经伦理委员会批准。
1.1.2 试剂
Real-time PCR所用试剂盒RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrigen life technologies公司；逆转录试剂盒购自美国Promega公司；RT-PCR试剂盒、TaKaRa RNA kit购自大连宝生物工程有限公司；CD34，MMP-2鼠抗人单抗体、相应二抗Elivision两步法试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及cDNA合成
分别取胃癌组织及其癌旁组织（距癌组织5 cm以上）约100 mg在液氮环境下研磨成粉，采用Trizol一步法提取mRNA，并应用紫外分光光度仪分别测定A260和A280值，以确定所提取的RNA的纯度。置-80℃保存待用。按照逆转录试剂盒说明书操作，将得到的RNA逆转录成cDNA。20 μL反应体系中包括总RNA 2 μg，5×Buffer缓冲液4 μL，25 nmol/L dNTPmix 1 μL，Oligo（dT）15 1 μL，RNA酶抑制剂1 μL，加DEPC水至20μL。整个配置过程在超净台冰上操作。反应条件：42℃ 1 h，45℃ 30 min，90℃ 3 min。反应产物-20℃冰箱保存待用。
1.2.2 引物设计和real-time PCR
采用Primer3软件设计THBS2引物，上游和下游引物分别设计在不同的外显子上，其跨越的内含子足够大，以避免THBS2基因组DNA的扩增。利用管家基因GAPDH为内参基因。引物序列见表 1。
表 1 THBS2和GAPDH基因引物序列Table 1. Primer sequences of thrombospondin-2(THBS2)and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)genes
采用SYBR ExScript RT-PCR试剂盒，进行多份Real-Time PCR反应。在冰上预先配制多份反应液的各种试剂混合液，然后再分装至ABI公司产的专用扩增管中，再各自加入cDNA溶液，每份样品为3个复孔，选GAPDH（69bP）基因作内参基因。反应体系25 μL，参照说明书进行操作。反应条件为95℃预变性30 s，1个循环；95℃/15 s，58℃/30 s，68℃/35 s，40个循环。融解曲线分析：95℃/15 s，20℃/s，60℃/min，20℃/s，95℃/15 s，0.1℃/s。
1.2.3 数据分析和修正
以GAPDH为内参基因对各基因表达进行标准化，同时以T21癌组织表达为准，即其表达量设为1，量化其他样本的表达量；在调整基线循环和计算阈值后，采用2-ΔΔCt法比较THBS2的相对表达量，仪器自动根据得出的Ct值（threshold cycle）所得的Ct值运用相对定量的计算公式[5-6]，Δ Ctpatient=CtTHBS2-CtGAPDH，Δ Δ Ct=Δ Ctpatient-Δ CtT21（即RQ值），计算得出代表相对表达量的RQ值，为了便于统计，将RQ值取Log10进行分析。同时，根据有关资料[5-7]，设定RQ>0.5为THBS2 mRNA高表达组，RQ <0.5为THBS2 mRNA低表达组。PCR反应获得的数据用ABIPrism 7500 SDS软件进行分析[5-6]。
1.2.4 CD34和MMP-2免疫组织化学染色
采用Elivision两步法分别检测82例胃癌患者的癌和癌旁组织标本中CD34，MMP-2的蛋白表达水平。操作严格按照试剂说明书进行。
1.3 结果判定
1.3.1 MVD结果判定
CD34阳性染色定位于血管内皮细胞胞膜或胞浆，呈棕黄色。在肿瘤区任何一个被染成棕色的内皮细胞或内皮细胞簇，与邻近微血管、肿瘤细胞或结缔组织分开，均作为一个微血管计数；而管径较大且有较明显肌层，或管腔内有8个以上红细胞的血管不作为微血管计数以及纤维硬化、坏死的微血管均不计入总数。计数时先在低倍镜（×100）下全面观察切片，确定肿瘤内最高微血管密度区，然后计数5个高倍镜（×400）视野下的微血管计数，取平均数作为该病例的微血管计数[8]。
1.3.2 MMP-2结果判定
MMP-2蛋白均定位于肿瘤细胞胞浆或胞膜，以出现黄色颗粒为阳性染色。采用半定量积分法判断结果。光学显微镜下（×400）随机选取10个有代表性的视野计算阳性细胞百分率并计分，阳性细胞 <5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分。按细胞显色强度计分：无显色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两项分值相加若≥3分，为高表达， <3分为低表达。
1.4 统计学方法
所有的数据均采用SPSS 11.1软件进行分析，不同组之间的差异用t检验或χ2检验进行分析，以P <0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 THBS2 mRNA在胃癌与癌旁组织中的表达水平
应用Real-time PCR技术检测82例胃癌患者的癌与癌旁组织中THBS2 mRNA的表达水平，胃癌组织中THBS2 mRNA表达水平的均值为-1.1，而相应的癌旁组织THBS2 mRNA表达水平的均值为-1.64，二者间差异有统计学意义（P <0.05）；且胃癌组织THBS2 mRNA表达水平是相应癌旁组织的3.5倍（图 1）。
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图 1 82例胃癌患者的癌与癌旁组织中的THBS2 mRNA表达水平分布图（横杆代表每组的均值）Figure 1. Distribution of thrombospondin-2 (THBS2) mRNA levels in 82 gastric carcinomas and paraneoplastic tissues as determined by real-time polymerase chain reaction. The transverse bold lanes represent the mean value for each patient cohort. Note: Real-time quantitative PCR value (RQ value)=2-ΔΔCt2.2 胃癌组织中THBS2 mRNA表达与临床病理学特征的关系
82例胃癌患者的癌组织中THBS2 mRNA表达水平与其临床病理学特征关系见表 2，浸润全层的病例组THBS2 mRNA的表达水平明显高于未浸润全程的的病例组（P <0.05）；而THBS2的表达与年龄、肿物大小、分化程度及淋巴结转移无明显的相关（P>0.05）。
表 2 胃癌组织THBS2 mRNA表达与临床病理学特征的关系Table 2. Relationships of clinicopathologic parameters with thrombospondin-2(THBS2)mRNA expression in gastric tumors
2.3 THBS2 mRNA表达与MVD的关系
82例胃癌患者的癌组织中THBS2 mRNA表达水平与MVD呈正相关（r=0.35，P < 0.01，图 2）。这表明MVD随着THBS2 mRNA表达水平的升高而增加。
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图 2 THBS2 mRNA表达与肿瘤微血管密度相关性分析Figure 2. Correlation analysis of thrombospondin-2(THBS2)mRNA level and intratumoral microvessel density(MVD)2.4 THBS2 mRNA表达与MMP-2的关系
MMP-2阳性染色主要见于癌细胞的胞浆或胞膜中。43例THBS2 mRNA高表达的胃癌标本中，MMP-2高表达的16例，MMP-2低表达的27例；39例THBS2 mRNA低表达的胃癌标本中，MMP-2高表达的27例，MMP-2低表达的12例，两者密切相关（P=0.004，图 3，表 3）。
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图 3 胃癌组织中的CD34、MMP-2的表达（Elivision×400）Figure 3. CD34 and MMP-2 immunohistochemistry staining in gastric carcinoma(Elivision×400)A, B: MVD marked by CD34 in gastric carcinoma; A: high MVD, B: low MVD. C, D: MMP-2 staining in gastric carcinoma. MMP-2 is located in cytoplasm or cell membrance of tumor cells; C: Highly positive staining for MMP-2 in gastric carcinoma; D: Weakly positive staining for MMP-2 in gastric carcinoma表 3 THBS2 mRNA的表达水平与MMP-2的相关性Table 3. Correlation between thrombospondin-(THBS2)mRNA and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)expression in gastric carcinomas
3. 讨论
THBS家族由THBS1、THBS2、THBS3、THBS4以及软骨寡聚物基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）等5个成员组成，属于多功能细胞间质糖蛋白，并参与伤口愈合、突触发生、胚胎发育及肿瘤形成[9-10]。THBS2由3条相同肽链组成同源三聚体，具有与凝血酶、纤维蛋白原、纤维连结蛋白、肝素等多种物质结合的位点[4]。一系列的研究已表明THBS2可在多种肿瘤组织中表达并在肿瘤的发生发展中起重要作用[4, 10]，在胃癌研究中表明THBS2基因存在异常表达[11]。本实验研究结果显示：1）THBS2mRNA在胃癌组织中的表达水平是癌旁的组织3.5倍；2）THBS2 mRNA在胃癌中的表达与肿瘤组织浸润程度的密切相关。这都表明THBS2在胃癌的发生发展中起重要的作用。
肿瘤新生血管生成在肿瘤的生长和转移过程中是必不可少的。THBS2在肿瘤新生血管生成起重要调节作用。但有关THBS2在肿瘤血管的作用机制尚未十分明确。有学者认为，THBS2结构上与THBS1相似，都具有TSRs结构，其能和CD36结合，抑制血管内皮细胞的迁移和管腔的形成或通过激活Caspase-3等途径来诱导血管内皮细胞凋亡而抑制血管新生[9]。本研究显示，胃癌患者的癌组织中THBS2 mRNA表达水平与其MVD呈正相关，Streit等[12]在动物实验中发现高表达的THBS2可抑制肿瘤血管的密度和数量的增加，并促进肿瘤细胞凋亡从而抑制鳞癌、恶性黑色素瘤等肿瘤的生长，推测THBS2是一种有效的内源性肿瘤生长和血管生成抑制物。但与本研究结果不一致，MVD随着THBS2 mRNA表达水平的升高而增加。本研究胃癌组织中显示浸润全层的的病例组THBS2 mRNA的表达水平明显高于未浸润全层的病例组（P <0.05），提示THBS2可能通过调节胃癌血管生成，从而影响肿瘤的生长和侵袭，提示预后不良，与Kodama等[13]在女性生殖系统肿瘤中的研究结果一致。这可能与肿瘤组织异质性有关，还可能由于THBS2是一种多功能细胞间质糖蛋白，其本身具有与纤维蛋白原、纤维连接蛋白、肝素等多种物质的结合位点的特点，与VEGF、EGF、TGF-β1等多种细胞因子也可相互作用，因此其具体的作用机制和作用途径仍然有待于进一步的研究。
胃癌的发生、侵袭和转移是一个多基因、多因子共同作用的复杂过程。本研究结果显示，胃癌组织中THBS2 mRNA的过表达与MMP-2表达水平密切相关（P=0.004），过度表达的THBS2对MMP-2有下调的作用。提示THBS2可能是MMP-2的重要调控子，THBS2可以通过与MMP-2发生复杂的交互作用影响细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑进而影响胃癌的侵袭转移[14]。MMP-2是一种重要的ECM降解酶，在肿瘤的侵袭、生长、转移中起着至关重要的作用，其可降解、破坏靠近肿瘤表面的ECM和基底膜，使肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，促进肿瘤侵袭和转移[15-16]。有研究发现THBS2可通过脂蛋白受体与MMP-2形成THBS2/MMP-2复合物，限制MMP-2的表达[17]。Yang等[14]研究也发现THBS2基因缺失的小鼠模型组其MMP-2的含量高于野生型小鼠组；而当对THBS2基因缺失的小鼠模型转染THBS2后，MMP-2表达则出现下调，与本文研究结果相一致。但其具体作用及机制有待进一步研究。
综上所述，THBS2可能在胃癌发生和发展中起重要的作用，并可能通过调节MMP-2的表达，影响肿瘤生长和侵袭转移。其确切的作用及机制还有待进一步研究。
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图 1 82例胃癌患者的癌与癌旁组织中的THBS2 mRNA表达水平分布图（横杆代表每组的均值）
Figure 1. Distribution of thrombospondin-2 (THBS2) mRNA levels in 82 gastric carcinomas and paraneoplastic tissues as determined by real-time polymerase chain reaction. The transverse bold lanes represent the mean value for each patient cohort. Note: Real-time quantitative PCR value (RQ value)=2-ΔΔCt
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图 2 THBS2 mRNA表达与肿瘤微血管密度相关性分析
Figure 2. Correlation analysis of thrombospondin-2(THBS2)mRNA level and intratumoral microvessel density(MVD)
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图 3 胃癌组织中的CD34、MMP-2的表达（Elivision×400）
Figure 3. CD34 and MMP-2 immunohistochemistry staining in gastric carcinoma(Elivision×400)
A, B: MVD marked by CD34 in gastric carcinoma; A: high MVD, B: low MVD. C, D: MMP-2 staining in gastric carcinoma. MMP-2 is located in cytoplasm or cell membrance of tumor cells; C: Highly positive staining for MMP-2 in gastric carcinoma; D: Weakly positive staining for MMP-2 in gastric carcinoma
表 1 THBS2和GAPDH基因引物序列
Table 1 Primer sequences of thrombospondin-2(THBS2)and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)genes
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表 2 胃癌组织THBS2 mRNA表达与临床病理学特征的关系
Table 2 Relationships of clinicopathologic parameters with thrombospondin-2(THBS2)mRNA expression in gastric tumors
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表 3 THBS2 mRNA的表达水平与MMP-2的相关性
Table 3 Correlation between thrombospondin-(THBS2)mRNA and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)expression in gastric carcinomas
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