子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在世界范围内呈上升趋势^[1]。子宫内膜癌被认为是一种雌激素依赖型肿瘤，其发生与无孕激素拮抗的雌激素长期作用相关。目前，肥胖、高血压、糖尿病等因素被视为子宫内膜癌发病的高危因素^[2]。然而，以拮抗雌激素受体为基础的激素治疗并非对所有雌激素受体阳性子宫内膜癌患者均有效，推测可能存在雌激素-雌激素受体通路以外的其他信号通路促进或介导子宫内膜癌的发生。同时，子宫内膜癌治疗后的复发率较高。目前对于子宫内膜癌尚缺乏早期诊断方法，以致一旦出现症状而被确诊时，相当一部分患者已为发病的晚期。因此，阐明子宫内膜癌发生发展的分子生物学机制，探索和寻找其诊治新靶点，以达到治疗的目的，也是子宫内膜癌研究领域的前沿课题。近年研究已证实过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）与脂肪细胞分化、肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病及肿瘤等多种疾病密切相关^[3]，与子宫内膜癌的发生发展也必然有一定关系。鉴于雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）、雌激素受体β（estrogen receptor β，ERβ）和PPARγ均属于细胞核受体，核受体之间存在交互作用，在子宫内膜癌领域中关于此三者相互联系的报道较少。因此，本研究通过免疫组织化学及蛋白印迹（Western blot）法检测子宫内膜癌组织中PPARγ、ERα和ERβ的表达，分析三者在子宫内膜癌组织中的相互联系，探讨其在子宫内膜癌发生发展中的作用。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   临床标本

收集2010年1月至2012年10月山东大学齐鲁医院妇产科住院因子宫内膜癌行子宫切除术组织标本45例（组织学类型均为腺癌，其中高分化腺癌14例，中分化腺癌17例，低分化腺癌14例）。术中子宫离体后迅速切取内膜癌组织并用液氮急冻，标记后存入-80℃。所有患者均为首诊，术前未行放疗、化疗及性激素药物治疗，无其他肿瘤史，年龄27~78岁，平均年龄50.24岁，中位年龄56岁。根据2009年子宫内膜癌手术-病理分期标准（FIGO）分为Ⅰ期23例，Ⅱ期12例，Ⅲ期9例，Ⅳ期1例。同时选取同期因子宫肌瘤行子宫切除术的正常子宫内膜组织标本13例作为对照。以上标本均经病理诊断证实，并经本院伦理委员会批准。

1.1.2   主要试剂

一抗：兔抗人PPARγ多克隆抗体（免疫组织化学工作浓度为1∶100；Western blot工作浓度为1∶500）购自Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人ERα单克隆抗体（免疫组织化学工作浓度为1∶50；Western blot工作浓度为1∶500）及兔抗人ERβ多克隆抗体（免疫组织化学工作浓度为1∶50；Western blot工作浓度为1∶500）购自Abcam公司。二抗：S-P免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉公司（SP-9001，SP-9002）；Western blot二抗山羊抗兔及山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标二抗（工作浓度1∶30 000）购自Bioworld公司。

1.2   方法

1.2.1   免疫组织化学S-P法

标本经10%福尔马林固定24 h，按脱水、透明、浸蜡、包埋程序处理，4 μm连续切片。免疫组织化学步骤严格按试剂盒说明书进行，切片常规脱蜡至水，微波抗原修复15 min，室温冷却，3%H₂O₂孵育10 min，山羊血清37℃封闭15 min，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育20 min，辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液37℃孵育15 min。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.2.2   Western blot法

组织裂解法提取蛋白，标本剪碎，加入细胞裂解液，匀浆器匀浆，4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白样品浓度。提取的蛋白中加入上样缓冲液，99℃加热10 min使其变性，-20℃保存。取20 μg蛋白于10%聚丙烯胺凝胶进行电泳，PVDF膜电转法转膜，200 mA恒流1.5 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光液于成像系统ImageQuant LAS 4000显色成像。

1.3   结果判定

1.3.1   免疫组织化学

采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组织化学结果进行定量分析，切片在光镜下按统一放大倍数（×400）进行分析，每例切片选取5个有代表性区域，统计其平均吸光度值（OD值），作为此例切片的染色强度。

1.3.2   Western blot检测

采用ImageJ 1.4.3软件分析各蛋白条带灰度值，比照内参（β-actin）条带灰度值，计算其相对灰度值，代表目的蛋白的相对表达量。

1.4   统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件分析数据，计量资料结果以x±s表示，数据比较采用t检验，采用Pearson相关计算各指标间相关系数。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   免疫组织化学检测结果

2.1.1   PPARγ、ERα和ERβ在不同子宫内膜组织中的表达

PPARγ、ERα和ERβ主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒为阳性细胞。在正常子宫内膜组织中，三者在腺细胞及间质细胞中均有表达；在子宫内膜癌中，三者主要在腺癌细胞中表达，间质细胞中表达略减少（图 1）。

图  1  免疫组织化学检测PPARγ、ERα和ERβ在不同子宫内膜组织中的表达（S-P×400）

Figure  1.  Immunohistochemical expression of PPARγ, ERα, and ERβ in different endometrial tissues(S-P×400)

A: Normal endometrium; B: Well-differentiated endometrial carcinoma; C: Moderately differentiated endometrial carcinoma; D: poorly differentiated endo⁃ metrial carcinoma

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2.1.2   PPARγ、ERα和ERβ的表达与病理分级及临床分期的关系

PPARγ的表达在正常子宫内膜及子宫内膜癌组织中以及在临床分期中存在显著性差异（P < 0.05），随着病理分级和临床分期的进展，PPARγ表达量逐渐降低。ERα在高分化子宫内膜癌组织中表达量较正常子宫内膜组织略有下降，但差异无统计学意义（P>0.05），而在中分化及低分化癌组织中表达量逐渐下降，并与临床分期相关（P < 0.05）。ERβ表达量则呈不同趋势，在正常子宫内膜及高、中分化子宫内膜癌组织中表达无显著性差异（P>0.05），仅在低分化子宫内膜癌中表达量下降（P < 0.05），与肿瘤分期、病理分级无明显相关性（表 1）。

表  1  PPARγ、ERα和ERβ的表达与病理分级及临床分期的关系 （x±s）

Table  1.  Relationship of PPARγ, ERα, and ERβ expression with pathological and clinical stage  (x±s)

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2.1.3   PPARγ、ERα和ERβ表达之间的相关性分析

Pearson相关分析显示，ERα与PPARγ在不同子宫内膜组织中表达量呈正相关（R²=0.916，P < 0.05），而ERα与ERβ、ERβ与PPARγ之间无相关性（图 2）。

图  2  ERα、ERβ及PPARγ蛋白表达间相关性分析

Figure  2.  Correlations among the expression of PPARγ, ERα, and ERβ

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2.2   Western blot检测结果

Western blot结果显示PPARγ的表达在正常子宫内膜及高、中、低分化子宫内膜癌中呈递减趋势，ERα在中分化及低分化癌组织中表达量明显下降，而ERβ仅在低分化子宫内膜癌中表达量减少（图 3）。与免疫组织化学结果趋势一致，进一步证实了本研究结果。

图  3  Western blot检测不同子宫内膜组织中PPARγ、ERα和ERβ蛋白表达

Figure  3.  Western blot results. The protein levels of PPARγ, ERα, and ERβ in different endometrial tissues

A: Protein expression bands of PPARγ, ERα, and ERβ; B: Image J software analysis showed the relative expression levels of PPARγ, ERα, and ERβ, with β-actin as the control sample; 1:normal endometrium, 2:well-differentiated endometrial carcinoma, 3:moderately differentiated endometrial carcinoma; 4:poorly differentiated endometrial carcinoma; *P < 0.05

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3.   讨论

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）由英国科学家Issemann和Green于1990年发现^[4]，存在3种亚型：PPARα，PPARβ，PPARγ。在3种亚型中，由于PPARγ与多种代谢性疾病及肿瘤形成密切相关而成为研究的热点。在子宫内膜癌领域中，关于PPARγ的研究并不一致，其中Ota等^[5]报道，子宫内膜癌组织中PPARγ表达量明显降低，而在Holland等^[6]的研究中，PPARγ在子宫内膜癌中表达量则明显升高。本研究采用免疫组织化学法及Western blot法检测PPARγ在子宫内膜癌组织中的表达，结果显示PPARγ在子宫内膜癌中表达量降低，且与子宫内膜癌的分化程度、临床分期呈负相关，在子宫内膜癌的发病和进展中起重要作用。最近研究^[7]发现，PPARγ被其配体激活后可以抑制肿瘤细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡，被认为是肿瘤治疗的潜在新靶点。本研究组前期研究通过构建裸鼠模型探讨PPARγ激动剂罗格列酮对子宫内膜癌移植瘤生长的作用，结果表明罗格列酮能够抑制肿瘤生长，有显著抑瘤效果^[8]，此项研究为PPARγ激动剂应用于子宫内膜癌的非手术治疗提供了理论基础。

雌激素受体与子宫内膜癌的关系已被广泛研究，前期积累的资料表明正常子宫内膜含有丰富的ER，而子宫内膜癌中ER含量则明显低于正常^[9]。其α亚型在子宫内膜癌中的表达也已明确，ERα的表达随肿瘤分期、分级的增加而减少，与肿瘤的病理特点和恶性程度密切相关^[10]，本研究结果与此一致。然而，关于ERβ在肿瘤进展中的重要功能仍存在争议^[11]，在子宫内膜癌发生发展中的作用尚未阐明。Hu等^[12]的研究显示，ERβ在子宫内膜癌的表达较正常子宫内膜显著降低，认为ERβ的下调与子宫内膜癌的发生有关。Mylonas^[13]分析了ERα及ERβ与子宫内膜癌临床病理及预后的关系，结果显示ERβ与肿瘤分级及预后无相关性。近期，Häring等^[14]采用实时定量反转录PCR技术分析子宫内膜癌组织中ERβ各亚型的表达，结果显示ERβ在子宫内膜癌中表达量升高，其认为ERβ的表达变化在子宫内膜癌的发生发展中更为重要，在子宫内膜癌中发挥致癌作用。另一项相关研究^[15]发现ERα/ERβ比值与癌浸润深度密切相关，ERβ是子宫内膜癌细胞肌层浸润最重要的因素。本研究提示，ERβ在正常子宫内膜及高、中分化子宫内膜癌中表达无显著性差异，仅在低分化子宫内膜癌中明显减少，且与肿瘤分期、分级无明显相关性。本研究结果与以上报道均提示，两种雌激素受体亚型可能存在不同的致癌途径，关于ERβ在子宫内膜癌中的作用及表达尚需大样本临床及病理学资料进一步研究证实。

同时，本研究进一步分析了ERα、ERβ和PPARγ三者之间的相互关系。有研究^[16]报道乳腺癌中，PPARγ与ER呈正相关，PPARγ被激活后能抑制ER与靶基因的结合能力，从而阻断雌激素信号传导途径，同时是ERα阳性乳腺癌患者较好的预后指标。但在Papadaki等^[17]的研究中却发现，PPARγ与ERα无相关性，而与ERβ相关，是ERβ阳性乳腺癌患者较好的预后指标。另有在肺癌的研究^[18]中报道PPARγ与ERα表达量在肺癌组织中明显增高，并可以根据其独特核受体表达情况选用相应治疗方法。可见PPARγ与ERα、ERβ间必定存在一定关联，三者间的确切关系有待证实。目前，在子宫内膜癌中关于PPARγ、ERα及ERβ关系的报道较少，且无一致结论。本研究结果提示ERα与PPARγ在不同子宫内膜组织中表达量存在明显正相关，为联合应用PPARγ激动剂及雌激素拮抗剂治疗子宫内膜癌提供理论依据。然而PPARγ、ERα、ERβ三者的具体调节途径及作用机制有待进一步研究。如何将理论研究应用于临床以达到对子宫内膜癌早期诊断、联合治疗及判断预后等也是下一步研究的重点。