肝细胞肝癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤^[1]，是亚洲和非洲国家死亡的最常见原因之一。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45%^[2]。近年来，尽管HCC诊疗技术得到明显改进，但对患者预后并无显著改善。近年来，越来越多的研究表明炎症在HCC的发生和发展中发挥重要的调节作用^[3]，而炎性微环境在促进肿瘤侵袭和转移中发挥的作用也受到越来越多的关注。慢性炎症可以通过诱导上皮间质转化(EMT)促进肿瘤侵袭转移，在结肠癌和乳腺癌中已被证实^[4]。同时，NTS/IL-8炎症通路活化介导的炎症反应也已经被证实在结肠癌的发生和转移中发挥关键作用^[5]。在本研究前期工作中，通过生物信息学的挖掘，发现HCC中NTS高表达与炎症基因表达增加密切相关。因此本研究通过免疫组织化学方法验证HCC中是否存在NTS的异位表达和NTS/IL-8通路活化，并探讨其在HCC侵袭转移中的作用和对临床预后的预测意义。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   标本

收集天津市肿瘤医院肝胆肿瘤科从2007年11月至2009年7月经部分肝切除手术治疗的肝细胞肝癌患者，共64例。其中，男性58例标本女性6例，年龄35~71岁，平均年龄54.44岁。患者均经病理诊断为肝细胞肝癌，术前未接受其他化放疗。其中，组织学分级为Ⅰ级4例，Ⅱ级36例，Ⅱ级24例，临床分期为Ⅰ期8例，Ⅰ期44例，Ⅲ期12例。术后随访时间为20~40个月。

1.1.2   试剂

鼠抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶9多克隆抗体(MMP-9)、鼠抗人β-连接素单克隆抗体(β-catemin)、鼠抗人上皮性钙黏附蛋白单克隆抗体(E-Cadherin)、鼠抗波形蛋白单克隆抗体(Vimentin)、CD68、通用型抗鼠/兔二步法检测试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒、均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Neurotensin(NTS)IL-8购自美国Enzo Life Sciences公司。

1.2   方法

1.2.1   免疫组织化学检测蛋白表达

切片经常规脱蜡、抗原修复、去内源性过氧化物酶及牛血清白蛋白封闭后，每个样品滴加50 μL的单克隆抗体分别为NTS、IL-8、VEGF、MMP-9、CD68、E-Cadherin、β-Catenin和Vimentin单克隆抗体4℃过夜，二抗37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染。对照设置：PBS替代一抗作为阴性对照。酒精梯度脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.2   结果评定标准

阳性细胞为细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒，其中NTS、IL-8、VEGF、MMP-9和Vimentin着色于细胞质，E-Cadherin着色于细胞膜，CD68和β-catemin着色于细胞质和细胞膜。每例标本在显微镜下随机选择10个高倍镜视野(×400)，每个视野计数100个细胞。采用双评分半定量法进行评价，细胞染色阳性率(PR)是在HCC样品中染色的阳性细胞的比例，其范围从0到3，分别代表≤10%、11%~30%、31%~60%和>60%。同样，着色强弱范围从0到3，分别代表无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色。这两种计分相加， < 4被定义为低表达或不表达，≥4被定义为高表达。

1.3   统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，阳性率的比较采用χ²检验及Pearson相关性分析，两指标表达相互关系用Spearman秩相关检测。64例癌组织根据性别、年龄、HBV感染的状态、既往的吸烟史和饮酒史、临床分期及预后被分成不同亚组，采用Kaplan-Meier法确定累积生存率，使用Log-rank检验期进行肝癌患者不同的蛋白标记物和总生存时间(OS) 之间的单因素分析。采用Cox比例风险模型进行多因素分析，筛选影响预后的独立因素。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   NTS与IL-8表达相关性

64例HCC患者肝癌组织NTS表达阳性率为17.19%(11/64)(图 1A)，主要分布在细胞质，呈棕黄色颗粒。在11例NTS⁺标本中NTS平均PR为50.00%± 11.62%，平均染色强度为2.91±0.3。IL-8表达阳性率为54.69%(35/64)(图 1B)，主要分布于细胞质，呈棕黄色颗粒。在NTS⁺标本中IL-8高表达的HCC组织阳性率是90.91%(10/11)，而在53例NTS-标本中IL-8高表达的组织阳性率仅为47.17%(25/53)(P= 0.006)，这提示NTS⁺HCC标本中IL-8表达率显著升高。同时比较NTS⁺HCC标本和NTS-HCC标本中IL-8蛋白表达量，发现11例NTS + 标本中IL-8平均PR为50.91% ±13.57%，显著高于53例NTS-HCC标本中IL-8的平均PR31.42%±29.39%(P=0.036)，且NTS和IL-8蛋白表达量之间呈正相关(R²=0.298，P < 0.05，图 1C)，提示在NTS⁺HCC标本中NTS⁺HCC标本中IL-8表达显著增加，即存在NTS/IL-8炎症通路的异常活化。

图  1  64例HCC标本中NTS与IL-8的组化表达结果(IHC×100)

Figure  1.  NTS/IL-8 pathway group detection in 64 cases of HCC tissues using the IHC staining method(IHC×100)

A: NTS; B: IL-8;C: Correlation curve of NTS and IL-8 expression

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   NTS与炎症相关蛋白VEGF、MMP-9和CD68表达相关性

HCC标本中，VEGF的阳性率为48.44%(31/64) (图 2A)，MMP-9的阳性率为45.31%(29/64)(图 2B)。MMP9在NTS +样品中的平均PR为(49.09 ± 25.57)%，显着高于在NTS-样品中的(23.58±26.13)% (P=0.004)。相反，VEGF在NTS⁺和NTS-样本的平均PR间的差异不显著，分别为(46.36±32.95)%和(32.55± 29.19)%(P=0.167)。然而，VEGF在NTS +IL-8 +HCC样本的表达显着高于其他HCC样本，分别为(55.00± 30.27)%和(31.02±28.92)%(P=0.020)。同时，可观察到NTS⁺IL-8⁺HCC样本中存在明显的CD68⁺TAMs浸润(图 2C)。这些结果表明，NTS/IL-8通路活化有利于肿瘤微环境中多种炎性因子释放和TAMs的募集，促进HCC炎性微环境的形成。

图  2  64例HCC标本中炎症相关蛋白质标志物的表达(IHC×100)

Figure  2.  Expression of inflammation-associated protein markers was detected in 64 cases of HCC tissues using the IHC staining method(IHC×100)

A: VEGF; B: MMP-9;C: CD68

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   NTS与EMT相关蛋白E-cadherin，β- Catenin和Vimentin表达相关性

在NTS⁺IL-8⁺肝癌样本中发现了EMT的特征，包括E-cadherin膜表达的丢失(图 3A)，β-Catenin和Vimentin细胞质积累的增加(图 3B~3C)。统计分析表明，在肝癌组织中E-cadherin和β-catenin的表达与IL-8的水平显着相关，(E-cadherin的Rcad=0.299，Pcad=0.002；β-catenin的Rcat=0.247，Pcat=0.020)，这提示在肝癌细胞中，NTS/IL-8炎症通路的异常活化引起IL-8表达上调可能会促进EMT。

图  3  64例HCC标本中EMT相关蛋白质标志物的组化结果(IHC×100)

Figure  3.  Expression of EMT-associated protein markers was detected in 64 cases of HCC tissues(IHC×100)

A: E-Cadherin; B: β-catenin; C: Vimentin

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  1  64例肝癌患者不同的临床和病理参数对生存的影响   月

Table  1.  Effect of different clinical and pathological parameters on the survival of 64 HCC patients  (months)

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   NTS与HCC患者临床预后的相关性

在不同性别，年龄，HBV感染情况，饮酒史或临床分期的患者之间显示的总生存期OS没有统计学差异。单因素分析比较患者OS与NTS，IL-8，MMP-9，和VEGF表达水平之间的关系，发现NTS的表达水平对HCC患者的OS具有重大影响，其中NTS⁺HCC患者的OS明显短于NTS-HCC患者(P=0.035)。同样，多变量Cox回归分析表明NTS⁺IL-8⁺患者的OS是其他患者的1/3(P=0.011)，提示NTS和IL-8同时表达是HCC患者OS的独立预后因素。相比没有NTS⁺IL-8⁺共表达的肝癌患者，NTS⁺IL-8⁺肝癌患者的OS显著下降[(24.65±4.45)个月vs.(75.79±16.32)个月，P=0.013]，并且这些患者在预期危险比(HR)为3.457的较高死亡风险值下。通过K-M生存分析发现NTS和IL-8双阳性HCC患者的OS较单阳性和阴性患者明显缩短，分别为(24.65±4.45)个月与(75.79±16.32)个月(P= 0.036)，提示NTS/IL-8炎症通路异常活化的HCC患者预后较差。

3.   讨论

NTS是一个含有13个氨基酸的神经肽，1973年首次由Carraway等^[6]从牛的下丘脑中分离。NTS广泛表达在人类和动物的大脑和胃肠道中，作为一种神经内分泌肽，NTS显着作用于多巴胺能系统，对降低血压，调节胃肠道功能起着重要的作用^[7]。近年来，研究已表明，NTS可以为多种类型上皮细胞来源的恶性肿瘤提供一种生长信号促进肿瘤的增殖，包括结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、头颈肿瘤^[8]。NTS/IL-8炎症通路已证实参与结肠癌的发生和转移过程，而这一过程与TGF信号介导EMT有密切关系^[9]，但NTS在肝癌中的表达情况和临床病理意义目前尚不清楚。

本课题组前期工作中，利用Affymetrix公司的人类全基因组表达谱芯片(human genome U133 plus 2.0)对10例随机选择的原发性肝细胞癌标本中多种转录产物的表达情况进行检测，并与癌旁正常组织进行比较。并从肝细胞肝癌标本中分离出一个独特的亚群，该亚群高表达NTS，并伴有以IL-8升高为代表的多种炎症相关基因的过表达，以及显著增加的细胞迁移等特征。

文献报道，NTS在胎儿肝脏中短暂表达，在正常成熟的肝脏和原发性肝癌组织中消失^[10]。IHC结果表明NTS蛋白主要表达在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中，而不是基质细胞，这意味着在一些肝癌样本中存在NTS表观异位表达，这与Tang等^[11]在细胞系中获得的结果一致。同时免疫组织化学结果也进一步证实了本研究在基因表达谱芯片中的发现：NTS与IL-8的表达呈正相关，表明NTS/IL-8通路在一些肝癌样本中存在异常激活^[12]。

EMT是一个生物过程，使上皮细胞经过多次的生化变化，能够具有一个间质表型，这种表型是上皮源性癌症复发和转移的一个重要的分子基础^[13-14]。在NTS⁺IL-8⁺肝癌样本中观察到多种炎症相关蛋白，如VEGF、MMP-9表达显著升高，CD68⁺ TAMs浸润程度增加，提示NTS/IL-8通路的异常活化导致HCC中炎症反应提高^[15]。NTS +IL-8 +肝癌样本还表现出E-Cadherin膜表达丢失和胞浆内β-catenin和Vimentin堆积等EMT特征，提示NTS/IL-8通路活化参与HCC中炎性微环境形成和EMT发生。

在探讨肿瘤中NTS和IL-8的共表达与临床预后的相关性，发现术后NTS⁺IL-8⁺HCC患者的OS显著缩短，而死亡风险明显升高，死亡率比非NTS和IL-8共表达的患者高2.5倍，提示NTS/IL-8通路的异常活化影响术后HCC患者预后，而这可能与NTS/IL-8通路活化引起的慢性炎症和EMT导致HCC侵袭性增加有关^[16]。

本研究通过生物信息学分析和免疫组织化学染色法证实在HCC中存在NTS/IL-8通路的异常活化，并通过促进局部炎症微环境的发展和增加肿瘤细胞的侵袭能力，影响HCC患者预后。这一发现可能为HCC的分子分型、疗效预测和靶向治疗提供了一个有价值的生物标志物。