胰岛素生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）及其受体（IGF1 receptor）促进细胞增殖并抑制凋亡，在肿瘤发生发展中的作用是当前研究的热点。IGF1的生物学功能由其表面的特异性靶细胞受体（IGF1R）介导，IGF1R在包括卵巢在内的很多组织中对细胞转化和肿瘤发生起重要作用，它能激活MAPK和PI3K/AKT信号通路。AKT即蛋白激酶B，对细胞增殖、凋亡和细胞周期起调控作用。最近发现，IGF1信号通路在卵巢癌耐药过程中可能起重要作用，其中的关键蛋白有望成为治疗卵巢癌的有效靶点^[1]。尽管越来越多的证据表明IGF1/IGF1R/AKT在诸多肿瘤的发生和发展中起重要作用，但其在肿瘤患者血液及组织中的表达尚不清楚，其关键蛋白在耐药的卵巢患者血中的表达情况及与多药耐药蛋白表达的相关性鲜见报道。本研究采用ELISA方法及检测对顺铂耐药及敏感患者血清中IGF1、IGF1R、AKT以及MRP2的表达，并进行相关性分析，免疫组织化学方法检测对顺铂耐药及敏感患者血清中IGF1、IGF1R、AKT的表达，探究IGF信号通路是否参与顺铂耐药，旨在为卵巢癌治疗找出新的治疗靶点。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   临床资料

南通市肿瘤医院2009年1月至2010年1月收治的40例卵巢上皮性恶性肿瘤（包括浆液性肿瘤、黏液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤）患者，年龄35~68岁，平均年龄52岁，中位年龄48岁。所有患者均经手术后病理证实且术前未经过化疗、放疗、内分泌及生物治疗。所有研究对象近半年内未服用过免疫调节剂和激素类药物。手术病理分期按国际妇产科联盟（FIGO2009年）标准，Ⅰ~Ⅱ期3例，Ⅲ~Ⅳ期37例。患者入院后均接受肿瘤细胞减灭手术+铂类为主的化疗。手术当日留取新鲜标本供顺铂耐药试验使用。全部患者术后6个正规疗程化疗结束后1个月内留取血清标本，4 000 r/min离心5~10 min，取上层血清，-80℃低温冰箱冻存，供检测用。

1.1.2   主要试剂和仪器

ATP-TCA试剂盒，包括完全培养液（CAM），肿瘤组织消化酶（TDE），ATP抽提剂（TCE），荧光素-荧光素酶（LU-LU），稀释缓冲液（DB），ATP标准液均购自湖州海创生物科技有限公司。Orion Ⅱ发光分析仪，Airtech生物安全柜购于德国Berthold公司。311型CO2培育箱购自美国Thernic公司。Olympus CKX-41倒置显微镜购自日本。离心机、单道/多道可调式移液器，96孔无菌微孔培养板购自德国Eppendorf公司。各种化疗药物的100%血浆峰值浓度（peak plasma concentration，PPC）及生产公司如下：江苏恒瑞药业产阿霉素（Doxorubicin，ADM），100%PPC为3 μg/mL；山东齐鲁制药产顺铂（cisplatin，DDP），100%PPC为6.3 μg/mL；山东齐鲁制药产卡铂（Carboplatin，CBP），100%PPC为25 μg/mL。

人胰岛素样生长因子1（IGF-1），人胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R），人磷酸化的Akt蛋白（P-Akt）和人多药耐药相关蛋白2（MRP2）检测均采用酶联免疫吸附（ELISA）方法，试剂购自GBD公司。酶标仪和洗板机均购自美国伯乐公司，型号分别为Bio-RAD1575和Bio-RAD680，操作步骤严格按说明书进行操作。

人胰岛素样生长因子1（IGF-1）免疫组化试剂盒一抗购自北京中杉金桥生物有限公司。人胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）免疫组化试剂盒一抗，型号为T2634，人磷酸化的Akt蛋白（P-Akt）购自EPIT⁃ MICS公司。型号为2118-1，二抗购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2   方法

1.2.1   ATP- TCA法操作步骤

主要步骤如下：术后0.5 h内无条件下切取新鲜的实体瘤标本（0.5~2.0 mm²）并剪碎洗，经酶解液酶解，检测培养基孵育2~6 h，离心成胞悬液，制备肿瘤细胞悬液。根据待测药物的临床使用剂量及其所对应的血浆峰值浓度（peak plasma concentration，PPC），设定6个检测浓度，即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的PPC。每个浓度作3个平行孔。同时设定MO：无药对照孔，MI：最大抑制孔。肿瘤细胞悬液加入含化疗药的无血清培养基中培养1周左右，加入ATP提取液抽提肿瘤细胞的ATP，混匀后再加入荧光素-荧光素酶试剂Orion Ⅱ发光分析仪上检测其荧光值。

1.2.2   肿瘤生长抑百分率的计算

TGI=1.0-（Test-MI）（/ MO-MI）×100%（Test：被测药物孔的平均荧光值；MI：最大ATP生成抑制对照孔的平均荧光值；MO：无药物对照孔的平均荧光值）。利用系统软件描绘药物剂量-抑制曲线，并据曲线得出IC₅₀（抑制50%肿瘤生长的药物浓度）、IC₉₀（抑制90%肿瘤生长的药物浓度）、抑制率曲线下面积（AUC），和抑制参数Index[Index＝600-Σ（TGI6.25 + … + TGI200）]。药物敏感度分级定义：强敏感：AUC≥12 500或Index＜300；IC₉₀≤90% PPC；IC₅₀≤25% PPC。部分敏感：AUC≥12 500或Index＜300；IC₉₀>90% PPC；IC₅₀≤ 25%TDC。弱敏感：AUC≥12 500或Index＜300。耐药：AUC＜12 500或Index≥300。

1.2.3   ELISA法操作步骤

IGF1、IGF1R、Akt和MRP2实验步骤类似，操作过程如下：加入稀释好后的标准品，加入反应孔内。立即加入50 μL的生物素标记的抗体。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。每孔加入100 μL的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。每孔加入底物50 μL，轻轻振荡混匀，37℃温育5 min。避免光照。取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.2.4   免疫组织化学法操作步骤

上述40例手术标本10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片HE染色，由病理科医师诊断核实。二步法检测IGF1；SP法检测AKT；PV9000法检测IGF1R，操作步骤严格按照说明书进行。结果判定表达结果以细胞染成黄色、黄褐色及棕褐色为阳性，计算阳性细胞数所占总细胞的百分比，取5个视野的算出平均值。1）根据显色细胞的比例计分：0分（显色细胞为0%）；1分（显色细胞＜10%）；2分（显色细胞10%~50%）；3分（显色细胞51%~80%）；4分（显色细胞>80%）。2）根据细胞染色强度计分：0分（细胞无显色）；1分（浅黄色）；2分（棕黄色）；3分（黄褐色）。积分=染色强度×阳性细胞数，积分范围0~12分，≥4分定义为阳性表达。

1.2.5   临床随访

自患者完成化疗出院后嘱每月复查CA125，如CA125有异常则复查彩超或者CT或者MRI，随访时间为1年，至本院检验科了解患者CA125变化情况，如有异常则至影像科了解是否进行CT或者MRI检查，电话形式随访了解患者自诉症状。

1.3   统计学方法

本资料采用SPSS 10.0统计软件，用t检验分析相关数据，采用x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   ATP-TCA法对40例卵巢癌患者手术标本进行顺铂药敏检测

40例卵巢癌药敏结果发现16例出现顺铂耐药，24例无耐药（图 1）。

图  1  ATP-TCA结果显示不同个体的卵巢癌细胞对3种化疗药物的敏感性

Figure  1.  ATP-TCA results exhibited the sensitivity of various individual ovarian cancer cells to three chemotherapeutic drugs

A. Curves of cisplatin（DDP）drug resistance；B. Moderate sensitivity of carboplatin（CBP）；C. Moderate sensitivity of doxorubicin（ADM）

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   耐药组和敏感组患者血清中IGF1表达比较

16例顺铂耐药组患者血清中IGF1表达值为35.869 4±4.559 7，24例顺铂敏感组患者血清中IGF1表达值为20.717 5±3.745 9，耐药组明显高于敏感组，两组相比差异有统计学意义（P=0.000 1）。

2.3   耐药组和敏感组患者血清中IGF1R表达比较

16例顺铂耐药组患者血清中IGF1R表达值为182.613 ± 19.392 1，24例顺铂敏感组患者血清中IGF1R表达值为127.671 5±22.989 9，耐药组明显高于敏感组，两组相比差异有统计学意义（P=0.000 1）。

2.4   耐药组和敏感组患者血清中AKT表达比较

16例顺铂耐药组患者血清中AKT表达值为48.605 0±6.662 9，24例顺铂敏感组患者血清中AKT表达值为29.738 0±6.807 9，耐药组明显高于敏感组，两组相比差异有统计学意义（P=0.000 1）。

2.5   耐药组和敏感组患者血清中MRP2表达比较

16例顺铂耐药组患者血清中MRP2表达值为35.869 4±4.559 7，24例顺铂敏感组患者血清中MRP2表达值为20.7175±3.7459，耐药组明显高于敏感组，两组相比差异有统计学意义（P=0.000 1）。

2.6   IGF1、IGF1R、AKT和MRP2两两相关性分析

IGF1与IGF1R相关（P=0.000 1，r=0.755），IGF1与AKT相关（P=0.000 1，r=0.812），IGF1R与AKT相关（P=0.000 1，r=0.643），IGF1与MRP2相关（P=0.018，r=0.493），IGF1R与MRP2无相关性（P=0.173，r=0.231），AKT和MRP2无相关性（P=0.106，r=0.274）。

2.7   免疫组织化学结果

IGF1表达于细胞浆，耐药组呈强阳性表达，敏感组呈弱阳性或者阴性表达，顺铂耐药组和敏感组IGF1的表达相比较有统计学意义（P＜0.05，图 2A、B）；IGF1R表达于细胞核和细胞浆，耐药组呈强阳性表达，敏感组呈弱阳性表达，两者相比较有统计学意义（P＜0.05，图 2C、D）；AKT表达于细胞浆，耐药组呈强阳性表达，敏感组呈弱阳性表达，两者相比较有统计学意义（P＜0.05，图 2E、F）。

图  2  两组IGF1、IGF1-R及AKT表达的免疫组织化学结果（H & E×200）

Figure  2.  Immunohistochemical results for IGF1, IGF1-R and AKT expressions in two groups (H & E×200)

A. Positive IGF1 expression in the cisplatin-resistant group; B. Weak positive IGF1 expression in cisplatin-sensitive group; C. Positive IGF1R expression in cisplatin-resistant group; D. Weak positive IGF1R expression in cisplatin-sensitive group; E. Positive p-Akt expression in cisplatin-resistant group; F. Weak positive p-Akt expression in cisplatin-sensitive group

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.8   临床随访结果

随访40例患者化疗结束（化疗方案为紫杉醇+铂类）后每月复查CA125情况，顺铂敏感组24例中有18例患者超过一年CA125一直处于正常值范围；6例患者超过半年CA125处于正常值范围；耐药组中有16例患者化疗结束后半年内CA125上升高于正常值，彩超或者MRI检查提示有复发病灶。

3.   讨论

IGF1信号通路主要发挥促进细胞增殖和抗凋亡作用。目前研究证明，IGF1信号通路在子宫内膜癌^[2]、肺癌^[3-4]、乳腺癌和结直肠癌等众多恶性肿瘤的发展中起关键作用。在卵巢癌方面的研究开展较少，高华等^[5]研究胰岛素生长因子1及其受体在卵巢癌细胞增殖中的作用，提示IGF1信号通路参与卵巢癌的发生发展。而在卵巢癌化疗耐药方面的研究甚少，研究IGF1信号通路关键蛋白与多药耐药蛋白之间的相关性鲜见报道。本研究利用ATP-TCA法对卵巢癌手术标本进行药敏检测，ATP-TCA技术是目前较为理想、且惟一被药品监督管理部门许可使用的体外药敏检测方法^[6]。Neubauer等^[7]研究61例原发卵巢上皮癌ATP-TCA结果和临床化疗敏感性的相关性，该方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为90.0%、43.0%、62.0%和81.0%。本研究同时测定卵巢癌化疗方案中常用药物顺铂、阿霉素、卡铂进行药物敏感性测定。免疫组化检测手术标本组织中IGF1、IGF1R及AKT水平，因为患者术后化疗后标本获取困难，所以采取患者术后化疗后血清进行实验。检测耐药组和敏感组术后正规6个疗程化疗结束后血清中IGF1、IGF1R及AKT水平，分析其与多药耐药蛋白MRP2的相关性，旨在探讨IGF1信号通路是否参与耐药，为耐药卵巢癌的治疗寻找新的靶点。

卵巢癌预后差，其根本原因在于其化疗后易产生耐药，卵巢癌铂类耐药机制非常复杂，各个环节异常均有可能产生耐药，耐药的卵巢癌细胞表现均为细胞凋亡的明显减少^[8]。本研究显示，ATP-TCA法检出原发性顺铂耐药和敏感患者，临床随访研究结果证明与实验研究结果相似，但是由于样本量小，以及随访时间较短，如能得出3年或者5年生存率更有说服力。免疫组织化学结果显示耐药组中IGF1、IGF1R及AKT均为强阳性表达，与敏感组相比差异有统计学意义。ELISA法显示顺铂耐药组患者正规6个疗程化疗结束后血清中IGF1表达耐药组和敏感组相比，IGF1表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；IGF1R表达耐药组和敏感组相比，IGF1R表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；AKT表达耐药组和敏感组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。与张晔等^[9]研究AKT和p-AKT蛋白高表达与p-gp介导的胃癌MDR有关相似。Tas等^[10]测定了上皮性卵巢癌患者血清中IGF1及IGFBP-3的表达情况，非耐药患者的表达，与本研究结果不同。Eckstein等^[11]使用顺铂作用于卵巢癌A2780及BG-1细胞发现，耐药性的出现与IGF-1R及其下游PI3K/AKT的活化有关，纯化的IGF-1可以激活IGF-IR，使多个卵巢癌细胞系出现对顺铂耐药大致相符。推测铂类药物的耐药与IGF1信号通路异常活化有关，顺铂原发耐药的患者在整个化疗过程中IGF1信号通路一直处于开放状态，影响化疗疗效。但是，对于顺铂敏感的患者在化疗过程中IGF1信号通路是否参与作用导致继发性耐药有待进一步研究。

多药耐药相关蛋白家族导致细胞内的化疗药物浓度降低，使肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生耐药^[12]。MRPs是一类跨膜转运蛋白，广泛分布于正常组织中，但表达水平低，而在肿瘤组织中呈高水平表达。MRP2是MRPS家族一员，MRP2耐药谱特征对顺铂耐药^[13]。ELISA法显示顺铂耐药组患者正规6个疗程化疗结束后血清中MRP2表达耐药组和敏感组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。陈亮等^[14]研究提示MRP2与上皮性卵巢癌的耐药显著相关，对初治上皮性卵巢癌患者铂类为基础的化疗疗效的预测具有一定价值。且IGF1与MRP2有明显的相关性^[15]，再次证实IGF1与顺铂耐药有关，从患者血清中IGF1与IGF1R，IGF1与AKT有显著相关性来推断，IGF-I与IGF-IR结合并激活IGF-IR，导致自身磷酸化，激活下游的AKT信号通路，最后作用于与耐药相关的蛋白及因子。理论而言，IGF1R与MRP2有相关性，AKT和MRP2有相关性，但是本研究显示IGF1R与MRP2无相关性，AKT和MRP2无相关性，分析可能的原因为选取的标本例数不足，有待扩大样本量进一步深入研究；IGF信号通路错综复杂，可能另一条或者几条通路异常活化；实验误差；化疗药物的影响。

综上所述，IGF1信号通路关键分子IGF1、IGF1R和AKT在卵巢癌顺铂耐药患者中过表达并与耐药相关蛋白相关联，提示这些分子可能参与顺铂耐药，有关耐药分子机制有待进一步深入研究。