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摘要:目的 检测胶质瘤细胞系及组织中miR-106b~25基因簇成员miR-106b、miR-93、miR-25的表达情况。方法 运用实时定量PCR的方法检测不同人脑胶质母细胞瘤细胞系及不同病理级别胶质瘤标本中miR-106b~25基因簇成员miR-106b、miR-93和miR-25的表达水平。原位杂交技术检测含不同病理级别及瘤旁正常脑组织的胶质瘤组织芯片中miR-106b~25基因簇成员的表达情况，进而分析该簇miRNAs的表达与胶质瘤病理级别的相关性。结果 以正常脑组织表达量为基准，3种miRNA在所有检测细胞系中均有增高的趋势。收集43例胶质瘤标本中，RT-PCR结果显示，随着肿瘤病理级别的升高，3种miRNA在各组中的平均表达量也逐步升高。其中，miR-106b（F=4.479，P=0.018）和miR-93（F=3.493，P=0.040）各组间的表达差异均有统计学意义。而miR-25表达无明显的统计学差异（F=2.766，P=0.075）。原位杂交结果显示3种miRNA的表达在高级别胶质瘤中的表达量明显高于低级别肿瘤。Spearman等级相关分析表明3种miRNA的表达信号强度分布均与胶质瘤的WHO病理分级呈正相关，在miR-106b、-93、-25中的相关系数分别为rs=0.617（P＜0.001）、rs=0.438（P＜0.001）、rs=0.463（P＜40.001）。结论 miR-106b~25在胶质瘤中表达呈不同程度增高，并与肿瘤分级呈正相关。
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关键词:
- miR-106b~25 /
- miRNA表达 /
- 胶质瘤
Abstract:Objective To detect the expression of miR-106b~25 cluster in glioma cell line and tissues.Methods Real-time PCR was performed to determine the expression of miR-106b~25 cluster members (miR-106b, miR-93, and miR-25) in different human glioblastoma cell lines. Different pathological grade glioma specimens were surgically removed. In-situ hybridization was performed to detect the expression of miR-106b~25 cluster members in different pathological levels of glioma tissues.Results In the expression of the benchmark on normal brain tissues, three kinds of miRNAs in all test cell lines have a tendency to increase. Based on the expression of the pathological level Ⅰ average rate in 43 cases of glioma specimens collected after neurosurgical operations, the real-time PCR results showed that the average expression quantity of the three kinds of miRNAs in each group gradually increase. The increase in tumor pathological levels results in statistically significant expression differences of miR-106b and miR-93 between the groups (F=4.479, P= 0.018 and F=3.493, P=0.040, respectively). However, miR-25 expression differences between the groups have no statistically significant differences (F=2.766, P=0.075). In situ hybridization results show that the expressions of three miRNAs in high grade gliomas are significantly higher than that in the low-level tumor. Spearman rank correlation analysis results indicate that the expression of these miRNAs signal-intensity distribution is positively correlated with glioma, in accordance with WHO pathology classification. The correlation coefficient for miR-106b, miR-93, and miR-25 are 0.617, 0.438, and 0.463, respectively (P < 0.001).Conclusion The expression of miR-106b~25 cluster members is up-regulated in the glioma and is positively correlated with tumor grade.-
Keywords:
- miR-106b~25 cluster /
- miRNA expression /
- glioma
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miRNA是继小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）之后发现的一种稳定的大小为20~25个核苷酸的非编码小RNA，参与细胞的凋亡、增殖、分化、发育和代谢等生理过程。以往的研究报道，miR-106b~25基因簇成员miR-106b、miR-93、miR-25在多种肿瘤中表达异常[1-6]。故推测miR-106b~25家族可能与胶质瘤形成关系密切。本文采用实时定量PCR和原位杂交的方法对胶质瘤细胞系和组织及组织芯片中miR-106b~25基因簇成员miR-106b、miR-93、miR-25的表达情况进行检测，探讨其表达变化与胶质瘤恶性程度的关系和意义。
1. 材料与方法
1.1 对象
1.1.1 细胞系
人脑胶质母细胞瘤细胞系TJ899和TJ905为天津市神经病学研究所神经肿瘤室建立并保存；A172，U251，SNB19，LN229，LN308，U87恶性胶质瘤细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
1.1.2 临床胶质瘤标本
取自天津医科大学总医院神经外科手术，所有标本均经病理证实，经伦理委员会认可。液氮速冻后保存于-80℃。
1.1.3 组织芯片
组织芯片由陕西超英生物科技有限公司制备。
1.1.4 试剂和仪器
DMEM培养基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；RNA提取和RT-PCR相关试剂：Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；AMV试剂盒购自美国Promega公司；dNTP、RNAsin购自日本Takara公司；RT-PCR检测试剂盒Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit购自中国上海吉玛制药技术有限公司。原位杂交探针购自丹麦Exiqon公司，探针序列见表 1；原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DAPI细胞核分析试剂盒购自美国Sigma公司。
表 1 miRNA探针序列（5'-地高辛标记）Table 1. Probe Sequence of the miRNA(5'-DIG labeled)
1.2 方法
1.2.1 细胞与组织总RNA的提取
培养细胞及取液氮中保存的胶质瘤组织约40 mg用于总RNA提取，具体步骤参考文献[7]。提取的RNA用Nanodrop仪检测miRNA的质量和浓度（OD260/OD280为1.7~2.0），-80℃保存备用。
1.2.2 实时定量PCR
按照Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit（上海吉玛制药技术有限公司）的说明进行逆转录过程。扩增条件为95℃、10 min；95℃、30 s，62℃、30 s，40次循环。RT-PCR过程使用MJ-Real time PCR仪（美国BioRad公司）完成，使用U6作为内参。Opticon 2软件计算ΔC（t）值（2-ΔΔCT的计算方法）表示。以tumorsam表示肿瘤标本或细胞系内的表达，Con表示经U6校正后1倍量的目标基因表达。ΔΔCT的具体计算方法如下：
1.2.3 原位杂交
胶质瘤组织石蜡切片60℃烤片过夜；梯度脱蜡水合；每张切片加上含探针的20 μL杂交液（探针浓度为0.03ng/μL）。常规杂交封片，具体步骤参考文献[7]。荧光倒置显微镜DP-70观察，拍照。
1.3 统计学处理
所用实验数据分析使用SPSS 11.6统计软件包，RT-PCR结果采用ANOVA单因素方差分析，原位杂交结果采用χ2检验，表达相关性采用Pearson相关分析，按照P＜0.05作为检验水准。
2. 结果
2.1 胶质瘤细胞系中miR-106b~25的表达
提取8种胶质母细胞瘤细胞系和1份正常脑组织标本，RT-PCR检测miRNA的表达。结果表明，以正常脑组织为表达量为基准，miR-106b在LN229、U251和TJ905中表达增高，表达量分别为5.568 ± 5.424、4.324 ± 3.166和1.337 ± 0.472。miR-93在除SNB19和U87外的所有检测细胞系中表达增高，表达量分别为A172：2.935±2.572；LN229：17.350±7.185；LN308：1.946 ± 1.742；U251：3.600 ± 2.151；TJ899：1.849±0.862；TJ905：4.142±3.139。miR-25在除A172外的所有检测细胞系中均高表达，表达量分别为LN229：27.895 ± 3.147；LN308：1.763 ± 0.933；U251：5.121±3.834；U87：3.103±4.150；TJ899：1.898±1.723；TJ905：3.823 ± 2.118（图 1）。检测的细胞系中，仅有U251、LN229和TJ905中3种miRNA同时表达升高。
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图 1 RT-PCR检测体外培养细胞系（8种胶质母细胞瘤细胞系，N：正常脑组织标本）中miR-106b、-93、-25的表达量Figure 1. Expression of miR-106b, miR-93, and miR-25 in cell lines (including 8 glioblastoma cell lines, determined via real-time PCR2.2 新鲜组织中miR-106b~25的表达
收集胶质瘤标本43例，按2007年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ级3例，Ⅱ级9例，Ⅲ级15例，Ⅳ级16例。其中，男性28例，女性15例，年龄27.00±15.81岁。
所有胶质瘤标本均提取总RNA，逆转录后RT-PCR结果显示，以病理级别Ⅰ级组织的平均表达量基准，随着肿瘤病理级别的升高，3种miRNA在各组中的平均表达量也逐步升高。其中，miR-106b和miR-93各组间的表达差异具有统计学意义（F=4.479，P=0.018和F=3.493，P=0.040）。而miR-25的表达无显著性差异（F=2.766，P=0.075，表 2）。
表 2 实时定量PCR检测胶质瘤标本中miR-106b~25的表达Table 2. Expression of miR-106b~25 in glioma samples determined via real-time PCR
2.3 组织芯片中miR-106b~25的表达
组织芯片共80个点，按照2007年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ级10例，Ⅱ级13例，Ⅲ级34例，Ⅳ级18例，瘤旁组织5例；其中男性52例，女性28例，年龄40.50±16.65岁。
胶质瘤组织芯片中miR-106b~25的原位杂交结果显示3种miRNA的表达在高级别胶质瘤中的表达量明显高于低级别肿瘤中的表达量（图 2）。不同级别间的阳性信号强弱分布存在明显差异，随着肿瘤级别的增高，强阳性信号比例增加，Spearman等级相关分析表明3种miRNA的信号强度分布均与胶质瘤的WHO病理分级呈正相关，在miR-106b、-93、-25中的相关系数分别为rs=0.617，P＜0.001；rs=0.438，P＜0.001；rs=0.463，P＜0.001（表 3）。
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图 2 原位杂交检测胶质瘤组织芯片中miR-106b、-93、-25的表达（×200）Figure 2. The expression of miR-106b, miR-93, and miR-25 in glioma microarray determined via ISH(×200)表 3 胶质瘤组织芯片中miR-106b~25的表达（原位杂交）Table 3. Expression of miR-106b~25 in glioma microarray via ISH(by ISH)
2.4 胶质瘤细胞系中miR-106b、-93、-25表达的相关性分析
全基因组水平非编码DNA序列研究发现，有相当一部分miRNAs基因在染色体上的分布是非随机的，它们紧密相邻，排列成簇。而针对miRNA表达的研究表明，成簇排列的miRNA基因多会构成一个多顺反子而共同表达。但是，也有miRNA基因簇的成员尽管位于同一个转录体系中，但表达水平却不一致。而处于不同染色体上的旁系同源miRNA基因簇也存的高度表达一致性的情况，提示同源miRNA基因簇可能共享相同的顺式作用元件。本研究对胶质瘤组织标本中3种miRNA的定量表达结果进行相关性分析，发现3种miRNA的表达存在明显相关性，miR-106b与miR-93和miR-25之间的Pearson相关系数分别为0.796和0.652，而miR-93与miR-25之间的相关系数则为0.722，均达到了统计学显著性差异的标准（表 4）。这些结果均显示miR-106b~25在胶质瘤细胞系中表达增高，提示其在胶质瘤的发展过程中可能发挥着一定的作用。3种miRNA的定量表达的相关性分析结果表明3种miRNA的表达具有明显相关性，可能存在协同转录。
表 4 miR-106b、-93、-25表达的相关性分析Table 4. Correlation analysis of miR-106b, miR-93, and miR-25
3. 讨论
miRNAs是目前为止被研究得最多的ncRNA，它们通过调控mRNA向蛋白的转化过程而参与转录后调节，在多种生物学过程中扮演着重要的角色。事实上，在许多肿瘤中都发现了表达异常的miRNA。目前小样本肿瘤miRNA表达谱筛选出的异常表达的miRNA在肿瘤诊疗中显示出一定程度的作用。如高表达的miR-155与低表达的let-7a-2与肺癌的不良预后相关[1]。而在乳腺癌中，miR-10b、-125b、-145、-21、-155与乳腺癌的激素受体状况、侵袭和转移有直接关系[2]。给负荷肝癌的小鼠注射miR-26a的类似物（mimics）可以减小瘤体积[3]。
肿瘤形成发展过程中，miRNA所起的作用已被众多实验研究证实。通过对下游蛋白表达的调控，miRNA可以发挥原癌或抑癌基因的作用。而肿瘤中异常表达的miRNA还可以作为肿瘤诊断及预后判断的生物标记物，甚至于治疗的靶点[4-6]。
miR-106b~25基因簇染色体定位于7q22.1，由miR-106b、miR-93及miR-25 3个成员组成，与miR-17~92a-1以及miR-106a~363为旁系同源物。其3个组成成员分别与另外2个基因簇的对应的成员有着完全相同的“种子序列”：miR-106b与miR-93本身种子序列就完全一致，对应的miR-17、-20a、-20b与它们的种子序列也完全一样，而miR-25则与miR-92a-1、-92a-2、-363为旁系同源，而缺少了另2个基因簇中所含miR-18家族的对应成员。miR-17~92基因簇是第一个被确认的原癌性miRNA[8]，miR-106b~25因与其是同源物而引起我们的关注。以往的研究报道，miR-106b~25基因簇的成员在多种肿瘤中都可以观察到不同程度的异常高表达[9-14]，而抑制miR-106b~25的3个成员可以抑制肝癌细胞的周期进展，G1期细胞比例增加[15]，提高miR-106b~25的表达则可以促进BE食管细胞和肺成纤维细胞的增殖速率[16]，表明该簇miRNA同样在肿瘤中起着原癌样的作用。在本研究中采用实时定量PCR和原位杂交的方法分别检测了胶质瘤细胞系、新鲜切除的肿瘤标本和胶质瘤组织芯片中该簇miRNA的表达情况，并发现三者在高级别胶质瘤中比低级别肿瘤中的平均表达量高。而针对miRNA与肿瘤级别的相关性分析表明该簇miRNA的表达量与肿瘤的级别呈正相关，显示出其在胶质瘤的发展过程中可能发挥着一定的作用，需要进一步研究证实。
综上所述，miR-106b~25基因簇的成员在各级别胶质瘤组织中呈不同程度高表达，可能成为胶质瘤级别分类及预后的生物学标记的候选基因。
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图 1 RT-PCR检测体外培养细胞系（8种胶质母细胞瘤细胞系，N：正常脑组织标本）中miR-106b、-93、-25的表达量
Figure 1. Expression of miR-106b, miR-93, and miR-25 in cell lines (including 8 glioblastoma cell lines, determined via real-time PCR
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图 2 原位杂交检测胶质瘤组织芯片中miR-106b、-93、-25的表达（×200）
Figure 2. The expression of miR-106b, miR-93, and miR-25 in glioma microarray determined via ISH(×200)
表 2 实时定量PCR检测胶质瘤标本中miR-106b~25的表达
Table 2 Expression of miR-106b~25 in glioma samples determined via real-time PCR
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表 3 胶质瘤组织芯片中miR-106b~25的表达（原位杂交）
Table 3 Expression of miR-106b~25 in glioma microarray via ISH(by ISH)
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