Experimental study on the proliferation and invasion activity of the c-maf gene inhibited multiple myeloma RPMI8226 cells
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摘要:目的 探讨c-maf基因对多发性骨髓瘤细胞增殖、侵袭力的影响。方法 脂质体法用c-maf siRNA转染多发性骨髓瘤 细胞系RPMI8226，RT-PCR技术检测c-maf基因的表达，MTT实验和Transwell小室分别检测多发性骨髓瘤细胞增殖活性和侵袭 力的改变，流式细胞术检测细胞周期，Western blots检测相关蛋白的表达情况，并检测Caspase的活性。结果 c-maf siRNA有效地 转染入细胞并抑制了c-maf基因的表达。转染c-maf siRNA细胞的增殖活性及体外侵袭力均显著下降（P＜0.05），细胞周期阻滞在 G2/M 期，survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1 蛋白水平明显低于对照组（P＜0.05），Caspase-3/7 蛋白活性高于对照组（P＜ 0.05）。结论 c-maf siRNA可明显抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖活性及侵袭力。c-maf基因可做为多发性骨髓瘤基因治疗的靶基因。Abstract:Objective To investigate the effect of c-maf gene on the MM cells ' proliferation and invasion activity.Methods Lipofectin Reagent was used to transfect c-maf siRNA into multiple myeloma cell of RPMI8226. The mRNA expression level of c-maf was detected by RT-PCR.Cell growth curve was measured by MTT assay. Transwell chamber test was used to measure MM cells ' in vitro invasion activity. The cell cycle distribution were assessed by flow cytomentry. The protein expression levels of survivin，MMP-2, MMP-9, ARK5 and cyclin B1 were detected by Western blot. We also detected the activity of Caspase-3/7.Results The c-maf siRNA was effectively transfected into cells and the mRNA expression of the c-maf gene was inhibited.MTT test and Transwell chamber test showed that the proliferation and in vitro invasion activity of transfected cells were significantly lower than those of other two groups (P＜0.05). Cell cycle of c-maf siRNA transfected group cells was arrested in G2/M phase. The expression levels of survivin，MMP-2，MMP-9，ARK5，cyclin B1 and the activity of Caspase-3/7 between c-maf siRNA transfected group and the other two groups were statistically different (P＜0.05).Conclusion c-maf gene by c-maf siRNA can remarkably inhibit proliferation and invasion of multiple myeloma cell lines of RPMI8226. C-maf gene may be used as the target for multiple myeloma gene therapy.
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Keywords:
- c-maf gene /
- multiple myeloma /
- RNAi /
- proliferation /
- invasion, apoptosis
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多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）约占血液 系统疾病的10%，是起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤。 新型的靶向治疗药物，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米 在提高缓解率、改善生活质量及延长患者寿命方面 均优于传统治疗[1-3]。但是仍有相当部分患者疗效较 差，有待于我们发现新的治疗靶点。Hurt等[4]发现，约 50%骨髓瘤患者样本中 c-maf 存在高表达。生理 情况下，c-maf蛋白在浆细胞的细胞粘附、移动，细胞 周期调控等生理过程中发挥作用。本研究利用RNAi 技术沉默多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的c-maf基 因，观察其对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的增殖 和侵袭力的影响。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株：潍坊医学院冯永堂教授惠赠。Matrigel 胶：BD 公司产品，Transwell小室：Coster公司产品，c-maf干扰序列及对照序 列：Qiagen 公司产品，小鼠抗人 survivin、MMP-2、MMP-9、β-actin、ARK5、cyclin B1单克隆抗体均购自 美国 Santa cruz 公司，HPR 标记山羊抗小鼠 IgG 购自 北京鼎国生物公司，细胞总蛋白提取试剂盒：北京康 成生物公司产品，Caspase-3/7活性检测试剂盒：美国 Promega公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞复苏与培养
37℃水浴箱中复苏细胞，成功后置于CO2培养箱培养传代。
1.2.2 脂质体法转染多发性骨髓瘤细胞系
实验分 组：实验组（c-maf siRNA组）；阴性对照组（NC siRNA 组）；空白对照组（mock siRNA组）。24孔培养板中将 siRNA、脂质体混合液100 μL按照不同的试验分组进 行转染，镜下观察转染效果。
1.2.3 RT-PCR检测c-maf基因的表达 逆转录、扩增
逆转录、扩增目的基因。PCR反应条件：94℃变性45s，56℃退火50s，72℃延伸1 min，共25个循环。表达抑制率计算公式： 表达抑制率（%）=（1-c-maf条带平均灰度值/β-actin条 带平均灰度值）×100%。引物序列：c-maf：P1 5 '-AGCG GCTTCCGAGAAAAC-3 '，P2 5 '-ACTTGCGAGTGGGCTC AG-3 '；β-actin：P1 5 '-GACTGCCTGCCTCACTTT-3 '，P2 5 '-GCTGATCTCGGCTCTGT-3 '。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖抑制效应
分别取培养 1～7d各组细胞行MTT实验。以时间为横坐标，各组 OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.5 Transwell 小 室 侵 袭 试 验
Matrigel 胶 包 被 Transwell小室上室面。取转染后24 h的各组细胞1× 105个移到无血清培养基中，放入 Transwell 小室上 层。下室加入含 15%胎牛血清的培养基，置 5% CO2 培养箱24 h。取出Transwell小室，倒置显微镜下计数 下室面10个高倍视野细胞数，取平均值。
1.2.6 细胞周期检测
收集转染后0、24、48、72 h各 组细胞，乙醇固定过夜，RNA酶水浴消化后加入碘化 丙啶（PI，50 μg/mL），4℃放置 15 min 后流式细胞仪 检测。
1.2.7 Western blot 检测
survivin、MMp-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表达PBS漂洗、裂解细胞，蛋白 质定量、分离后PVDF膜上免疫杂交，洗涤后将滤膜 与标记的抗免疫球蛋白抗体温育。发光法确定靶蛋 白数值。
1.2.8 Caspase活性检测
取培养1、2、3 d的各组细 胞，按照试剂盒的操作说明将缓冲液与底物混合，混 合物100 μL加入等体积培养的细胞悬液后孵育3 h，酶 标仪检测并计算Caspase活性。
1.3 统计学分析
实验所得数据采用SPSS统计学软件处理，数据 以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 倒置荧光显微镜下观察转染后的细胞
在荧光显微镜下观察实验细胞，绝大多数细胞 都荧光着色，与背景反差明显，荧光着色细胞有明显 的细胞轮廓（图 1）。
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图 1 转染24 h后倒置荧光显微镜下观察转染后实验细胞（×100）Figure 1. MM cells under the fluoroscope at 24 h after transfectedion（×100）2.2 RT-PCR检测c-maf基因的表达
实验组条带亮度较阴性对照组和空白对照组明 显弱（图 2）。表达抑制率：c-maf siRNA 组：76.38%± 7.36%，NC siRNA 组：44.01%±6.31%，mock siRNA 组 38.66%±6.95%，差异有显著统计学意义（P＜0.05，表 1）。
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图 2 c-maf siRNA对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226 c-maf基因表达的影响Figure 2. Effect of siRNA on c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells表 1 c-maf siRNA抑制 c-maf 基因的表达Table 1. siRNA inhibits c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells
2.3 MTT法检测各组细胞的增殖活性
转染c-maf siRNA后第1、2d，各实验组增殖活性 无明显差异，48 h 的 OD 值，c-maf siRNA 组：0.65± 0.07，NC siRNA 组：0.66 ± 0.11，空白对照组：0.65 ± 0.17，无统计学差异（P>0.05），c-maf siRNA组较其他 两组在第 3～7d 出现差异，第 5d 差异最明显，此时 c-maf siRNA 组 OD 值：0.67 ± 0.08，NC siRNA 组 OD值：0.74±0.12，空白对照组 OD 值：0.75±0.29，比较有 统计学差异（P＜0.05）。以时间为横轴、OD值为纵轴 绘制生长曲线（图 3）。7d后由于培养基营养成分消 耗，失去统计意义。
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图 3 转染c-maf siRNA对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226增殖的影响Figure 3. The growth curve according to the MTT assay in different groups of RPMI8226 after transfection with c-maf siRNA2.4 沉默 c-maf 基因对人多发性骨髓瘤细胞系 RPMI8226体外侵袭力的影响
增殖抑制实验表明，c-maf基因沉默后第3d开始 出现显著差异。因此，为了减少细胞增殖对侵袭力 实验的影响，检测侵袭力的实验选定在转染后 24～ 48 h 进行。结果显示 c-maf siRNA 组、NC siRNA 组、空白对照组粘附于下室面的细胞数量分别为：35.66± 5.09、57.01±10.22、60.33±9.63。c-maf siRNA 组与其 余二组对比，差异有统计学意义（P＜0.05，图 4）。
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图 4 c-maf基因沉默对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226体外侵袭力的影响（*P＜0.05）Figure 4. The effect of c-maf siRNA on in vitro invasion activity of RPMI8226 cells2.5 流式细胞术检测细胞周期变化
c-maf siRNA组在转染后3天G2/M期比例逐渐增 加，由 16.20%升至 51.10%，细胞周期阻滞在 G2/M 期。c-maf siRNA组的细胞周期图出现亚二倍体凋亡 峰（图 5，表 2）。
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图 5 c-maf基因沉默对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞周期的影响Figure 5. The effect of c-maf siRNA on cell cycle progression of RPMI8226A：0 h；B：24 h；C：48 h；D：72 h表 2 转染后不同时间G2/M期细胞数量比例 （%）Table 2. The percentage of RPMI8226 cells in G2/M phase at different time points（%）
2.6 Western blot检测蛋白表达
Western blot 检测转染 72 h 后，c-maf siRNA 组、NC siRNA组、空白对照组的不同蛋白表达水平，结果 示 c-maf siRNA 组 Survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1均明显低于其他两组（P＜0.05，图 6）。
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图 6 转染后 RPMI8226 细胞的 survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表达的差异Figure 6. The expression of survivin, MMP-2, MMP-9, ARK5, and cyclin B1 protein in RPMI8226 cells after transfection2.7 Caspase-3/7蛋白活性检测
转染后，随着时间延长 c-maf siRNA 组细胞的 Caspase-3/7的活性逐渐增高，转染0、24、48、72 h，各 实 验 组 Caspase-3/7 活 性 为 ：c-maf siRNA：0.314 ± 0.029、0.468 ± 0.039、0.636 ± 0.052、0.786 ± 0.081，NC siRNA：0.314 ± 0.029、0.350 ± 0.035、0.361 ± 0.033、0.373±0.038，Mock siRNA：0.314±0.029、0.348±0.026、0.357±0.033、0.370±0.034。c-maf siRNA组和其他二 组比较差异有统计学意义（P＜0.05，图 7）。
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图 7 转染后RPMI8226细胞的Caspase-3/7蛋白活性的差异Figure 7. The change of Caspase-3/7 protein activity in RPMI8226 cells after transfection*P<0.05 c-maf siRNA group compared with other two groups3. 讨论
如前所述，c-maf基因在50%骨髓瘤患者标本中 异常高表达。研究显示[5-7]，转染外源性c-maf基因的 小鼠B细胞可发展为MM。在高表达c-maf的MM细 胞中，c-maf蛋白分子可促进新血管的生成；增加MM 细胞的迁移力；提高对周期特异性化疗药的耐受性 等。临床资料显示[8]，c-maf基因高表达者的肿瘤负 荷较高，对传统化疗的有效率较差，导致总体生存和 无进展生存较短。所以，c-maf基因高表达是MM患 者的预后不良因素。
在细胞周期检测中，沉默c-maf基因后细胞发生 了G2/M期阻滞，提示c-maf蛋白是通过促进细胞周期诱导细胞增殖。细胞周期蛋白研究较多的是 Cyclin D。但Park等[9]证实在多发性骨髓瘤细胞中有cyclin B的高表达。Tamura等[10]进一步研究证实，cyclin B1 表达水平较高的MM患者，有较快的细胞增殖速率，在相同的化疗周期间隔下，容易复发，所以对 cyclin B1高表达患者建议缩短化疗间隔。本实验证实抑制 c-maf基因的表达能下调cyclin B1，使细胞周期阻滞，所以靶向c-maf的药物能减缓MM细胞的增殖速率，减少化疗次数，降低复发率。凋亡峰的出现说明 c-maf也抑制了RPMI8226细胞的凋亡。细胞凋亡的 共同途径是Caspase的激活，Caspase酶是凋亡过程的 主要调控蛋白，Caspase-3是多种凋亡途径共同作用 的因子，其表达水平的高低决定着细胞凋亡程度 [11] 。Survivin是公认的凋亡抑制基因。本实验发现，转染 c-maf siRNA 的 RPMI8226 细胞 Survivin 蛋白表 达水平降低，而 Caspase-3/7 活性增高，提示沉默 c-maf 基 因 诱 导 RPMI8226 细 胞 凋 亡 与 上 调 Cas pase-3/7和下调Survivin基因表达有关。ARK5（AMPL-related protein kinase 5）是 AMPK（AMP-activated protein kinase）的亚家族成员之一，ARK5在各种肿瘤 细胞系中表达。有研究[12, 13]证实把 ARK5 基因转染 到乳腺癌细胞 MDA-MB-231，增强了其侵袭和转移 的能力，而沉默内源性ARK5基因则细胞侵袭转移能 力降低，并且细胞侵袭力和 MMP-2、MMP-9 蛋白的 表达呈正相关。Chen等[14]在人非小细胞肺癌细胞中 也得到了相似的结果。Morito等[15]发现在ARK5基因 启动子区有两个MARE序列，使c-maf蛋白分子能与 之结合，上调 ARK5 基因的表达。所以，ARK5 是 c-maf的下游靶基因。本研究发现，在沉默c-maf基 因后 ARK5、MMP-2、MMP-9 的蛋白表达均明显降 低，提示在 RPMI8226 细胞中 c-maf 基因很可能是通 过上调 ARK5 基因而高表达 MMP-2、MMP-9 从而获 得较强的侵袭活性。所以靶向 c-maf 基因的治疗可 通过下调ARK5进而降低MMP-2、MMP-9的水平，降 低瘤细胞的侵袭力，从而降低患者体内瘤细胞负荷，减少髓外转移、改善患者预后。
综上所述，本实验证实了通过沉默c-maf的表达 可明显抑制多发性骨髓瘤 RPMI8226 细胞的增殖及 侵袭力并诱导其凋亡，结合c-maf在增强多发性骨髓 瘤细胞粘附、迁移和血管发生等方面的作用，我们认 为靶向c-maf的治疗是可行的，将有可能成为MM基 因治疗的一种新的选择。
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图 1 转染24 h后倒置荧光显微镜下观察转染后实验细胞（×100）
Figure 1. MM cells under the fluoroscope at 24 h after transfectedion（×100）
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图 2 c-maf siRNA对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226 c-maf基因表达的影响
Figure 2. Effect of siRNA on c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells
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图 3 转染c-maf siRNA对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226增殖的影响
Figure 3. The growth curve according to the MTT assay in different groups of RPMI8226 after transfection with c-maf siRNA
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图 4 c-maf基因沉默对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226体外侵袭力的影响（*P＜0.05）
Figure 4. The effect of c-maf siRNA on in vitro invasion activity of RPMI8226 cells
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图 5 c-maf基因沉默对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞周期的影响
Figure 5. The effect of c-maf siRNA on cell cycle progression of RPMI8226
A：0 h；B：24 h；C：48 h；D：72 h
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图 6 转染后 RPMI8226 细胞的 survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表达的差异
Figure 6. The expression of survivin, MMP-2, MMP-9, ARK5, and cyclin B1 protein in RPMI8226 cells after transfection
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图 7 转染后RPMI8226细胞的Caspase-3/7蛋白活性的差异
Figure 7. The change of Caspase-3/7 protein activity in RPMI8226 cells after transfection
*P<0.05 c-maf siRNA group compared with other two groups
表 1 c-maf siRNA抑制 c-maf 基因的表达
Table 1 siRNA inhibits c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells
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表 2 转染后不同时间G2/M期细胞数量比例 （%）
Table 2 The percentage of RPMI8226 cells in G2/M phase at different time points（%）
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