Elucidating the proteomic characteristics and metabolic pathway activation in breast cancer bone metastasis
-
摘要:目的
探究乳腺癌骨转移细胞的蛋白表达特征及调控骨转移的分子机制。
方法制备过表达萤火虫荧光素酶的人乳腺癌细胞系MCF-7-luc和骨转细胞亚系MCF-7-BOM-luc；左心室注射细胞建立乳腺癌骨转移裸鼠模型；应用小动物活性成像仪、微计算机断层扫描技术（micro-computed tomography，Micro-CT）检测骨转移及骨小梁变化；采用Transwell小室法评估细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过蛋白质组学、蛋白质印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析差异蛋白表达、上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）指标和信号通路活化情况；使用2-NBDG、ELISA法和Seahorse能量代谢仪分别检测葡萄糖摄取、L-乳酸含量和细胞能量代谢参数。
结果MCF-7-BOM-luc细胞迁移、侵袭、EMT特性以及骨骼转移能力方面优于MCF-7-luc。蛋白质组学发现MCF-7-BOM-luc中S100钙结合蛋白A4（S100 calcium-binding protein A，S100A4）表达增加，且差异蛋白主要集中在代谢途径。MCF-7-BOM-luc表现出E盒结合锌指蛋白1/2（zinc finger E-box binding homeobox 1/2，ZEB1/2）和波形蛋白（Vimentin）表达上升，E-钙黏蛋白（E-cadherin）下降，葡萄糖摄取、L-乳酸生成和糖酵解速率增强，及细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）和信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化水平提升。
结论MCF-7-BOM-luc通过激活ERK1/2和STAT3信号通路促进S100A4表达，从而增强EMT进程和糖酵解速率，具备骨转移恶性。通过蛋白质组学解析乳腺癌骨转移细胞的蛋白特征将为乳腺癌骨转移的诊断、预防和治疗提供潜力靶点。
-
关键词:
- 乳腺癌骨转移 /
- 蛋白质组学 /
- S100钙结合蛋白A4 /
- 肿瘤代谢 /
- 信号通路
Abstract:ObjectiveTo investigate the protein expression characteristics of bone metastatic breast cancer cells and the underlying molecular mechanism driving bone metastasis.
MethodsA firefly luciferase-overexpressing human breast cancer cell line, MCF-7-luc, and its bone metastasis subline, MCF-7- BOM-luc, were established. Additionally, a nude mouse model of breast cancer bone metastasis was established by injecting the aforementioned cells into the left ventricle. Bone metastasis and trabecular changes were assessed using micro-computed tomography (Micro-CT). Cell migration, and invasion were evaluated using the Transwell assays. Differential protein expression and epithelial-mesenchymal transition (EMT) were analyzed using proteomics, Western blot, and reverse transcription-quantitative PCR (qPCR). We measured the glucose uptake, L-lactic acid content, and cell energy metabolism parameters using 2-NBDG, ELISA, and a Seahorse energy metabolizer.
ResultsMCF-7-BOM-luc cells exhibited stronger migration, invasion, and EMT characteristics as well as more pronounced bone metastasis capabilities than the MCF-7-luc cells. Proteomic analysis revealed increased S100 calcium-binding protein A (S100A4) expression in MCF-7-BOM-luc cells, with other differentially expressed proteins being primarily involved in metabolic pathways. Additionally, MCF-7-BOM-luc cells displayed increased expression of E-box binding homeobox 1/2 (zinc finger E-box binding homeobox 1/2, ZEB1/2) and Vimentin and reduced E-cadherin expression. MCF-7-BOM-luc cells also exhibited enhanced glucose uptake, L-lactic acid production, and glycolysis rates as well as increased phosphorylation levels of extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3).
ConclusionsMCF-7-BOM-luc cells promote S100A4 expression through ERK1/2 and STAT3 signaling pathway activation, which in turn enhances the EMT process and glycolysis rate, thereby contributing to malignant bone metastasis. Proteomic analysis of breast cancer bone metastasis-related protein characteristics could offer potential targets for the diagnosis, prevention, and treatment of breast cancer bone metastasis.
-
乳腺癌是威胁女性健康最常见的癌症类型。尽管手术、放化疗、激素、靶向和免疫等综合疗法在发展，但晚期患者转移复发的分子机制尚未被充分揭示，导致治疗策略相对受限。发生乳腺癌转移的患者5年生存率仅约为27% [1]。
乳腺癌最常见的器官转移是骨骼，其次是肺、肝和脑[2]。约70%的乳腺癌患者发生骨转移，导致预后不良和生存期缩短[3]。骨转移患者在晚期遭受剧烈疼痛，主要来自转移性肿瘤细胞群的机械压力以及肿瘤细胞和周围骨孔释放的炎性细胞因子[4]。此外，骨转移引起的活动受限、高钙血症、骨折、脊髓压迫和（或）骨髓再生能力下降等事件，严重影响患者的生存质量[5]。
本研究利用蛋白质组学揭示骨转移性乳腺癌细胞的蛋白表达特征，并结合seahorse实验分析骨转移性乳腺癌细胞代谢特征，为针对乳腺癌骨转移的治疗提供了潜在的靶点，具有重要的临床意义与价值。
1. 材料与方法
1.1 细胞系与主要试剂
人乳腺癌细胞系MCF-7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，骨转移细胞亚系MCF-7-BOM由MCF-7细胞筛选得到。过表达萤火虫荧光素酶（luc）的慢病毒载体、聚凝胺、嘌呤霉素、双荧光素酶报告基因试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司；0.25%EDTA-胰蛋白酶购自美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养液、PBS、青霉素/链霉素溶液、4%多聚甲醛购自大连美仑生物公司，结晶紫粉末购自美国Genview公司，d-萤光素钾盐生物发光底物购自美国PerkinElmer公司，CCK-8购自美国MCE公司。磷酸酶抑制剂、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度检测试剂盒、TRIzol总RNA抽提试剂、cDNA逆转试剂盒及SYBR Green预混液、RIPA缓冲液、ECL试剂盒、2-NBDG均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。PVDF膜购自美国Millipore公司，L-乳酸试剂盒购自Cayman公司，糖酵解速率分析试剂盒购自安捷伦公司，异氟烷购自瑞普（天津）生物药业有限公司。抗体波形蛋白（Vimentin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、ERK、p-ERKThr202/Tyr204、STAT3、p-STAT3Tyr705均购自Cell Signal Technology公司，抗体ZEB1、ZEB2购自Proteintech公司，抗体S100A4和GAPDH均购自杭州华安生物有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
细胞在含双抗青霉素和链霉素（100 mg/L）和10% 胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养液中培养，培养环境为37℃、5%CO2。每48 h换液1次，以保证细胞营养充足。经支原体检测为阴性后，在70%～80%的密度进行传代和后继实验。
1.2.2 MCF-7-luc和MCF-7-BOM-luc细胞株制备和luc值测定
使用萤火虫荧光素酶（luc）的慢病毒载体和聚凝胺（终浓度8 µg/mL）分别感染MCF-7-BOM和MCF-7细胞。使用嘌呤霉素梯度筛选2周后，得到MCF-7-luc和MCF-7-BOM-luc细胞。利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测细胞luc值，MCF-7-luc和MCF-7-BOM-luc-单细胞luc值均在150以上，可用于动物实验。
1.2.3 乳腺癌骨转移荷瘤小鼠模型的建立
动物实验的方案由上海中医药大学动物护理和使用委员会批准（批号：PZSHUTCM2303080009）。5周龄的雌性裸鼠购自斯莱克动物公司（中国上海），饲养于上海中医药大学动物实验中心。将裸鼠随机分为MCF-7-luc组和MCF-7-BOM-luc组，每组5只。将汇合度70%～80%的细胞用胰酶消化后，用PBS调整密度为5×106个细胞/mL，以100 µL/只注射到裸鼠左心室中。每日监测裸鼠体重与行为状态。
1.2.4 活体成像仪检测骨转移
裸鼠荷瘤4周后进行活体成像检测。小鼠腹腔注射150 mg/kg荧光素底物，使用R500系列气麻机（中国瑞沃德公司）麻醉小鼠，底物注射15 min后，使用Lumina XR小动物活体成像系统（美国PerkinElmer公司）采集图像。使用Living Image分析软件量化骨骼区域的荧光强度。
1.2.5 Micro-CT检测骨小梁的骨体积分数
将裸鼠安乐死后取出股骨，剔除肌肉组织后于阴凉通风处风干一周。将Quantum GX2小动物活体Micro-CT 影像系统（美国PerkinElmer公司）预热后，更换18 mm的动物床，设置电压90 kV，电流80 µA，扫描视野为18 mm，扫描时间14 min，将离体骨组织放入动物床中，调整成像视野，进行数据采集。使用Analyze 12.0软件分析股骨远端骨小梁的骨体积分数。
1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖力
将细胞以3×103/孔接种到96孔板中培养72 h。用不含血清的DMEM配制CCK-8工作液，每孔加入100 µL ，在培养箱中避光孵育2 h，使用Spark 10M多功能酶标仪、（瑞士TECAN公司）测量450 nm波长的OD值。以MCF-7-luc细胞的活力为100%，计算MCF-7-BOM-luc细胞的相对活力。
1.2.7 Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力
在8 µm孔的Transwell侵袭小室的上下室中加500 µL预热后的DMEM培养液，37℃水化2 h。水化完成后去除小室中的培养基，下室加750 µL 10%FBS-DMEM，调整细胞密度为4×105/mL，将500 µL细胞悬液接种于上室，细胞数量为2×105/孔，置于培养箱中孵育22 h。后继步骤同细胞迁移实验。
1.2.8 蛋白质组学检测及生信分析
培养MCF-7-luc和MCF-7-BOM-luc细胞，设置3皿重复。PBS洗涤细胞后，加入尿素与2%SDS裂解细胞蛋白并测定蛋白浓度，加入6倍体积的冰丙酮用于沉淀蛋白，−20℃沉淀过夜后，离心弃去上清，加预冷洗液洗涤沉淀2次，于通风橱风干至半干状态。加入盐酸胍重溶沉淀，取上清测定蛋白浓度。使用巯基乙醇溶液还原蛋白，加入IAM溶液烷基化蛋白质，使用超滤管收集烷基化后的蛋白，加入胰酶，37℃摇床90 rpm 反应过夜。次日进行脱盐处理，1‰甲酸水溶液复溶蛋白样品。采用纳米电喷雾液相色谱质谱（Nano-ESI-LC-MS）技术和比对数据库进行蛋白质检测、鉴定与定量。利用基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库对差异蛋白进行注释蛋白的二级功能和富集信号通路的分析。
1.2.9 实时荧光定量PCR分析基因表达
Trizol法提取总RNA。RNA逆转录为cDNA后使用SYBR Green 预混液和目的基因的引物在ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）中进行荧光信号的检测。PCR反应条件：95℃且2 min；95℃且15 s，60℃且30 s，循环 40 次。β-肌动蛋白（β-actin）用于归一化。以2-∆∆Ct法计算各目的基因相对于内参基因的表达量。所用引物由生工生物有限公司提供，引物序列见表1。
表 1 qPCR引物序列基因名称 引物序列（5'～3'） ZEB1 F：TGTTACCAGGGAGGAGCAGT R：TGCCCTTCCTTTCCTGTGT ZEB2 F：GCCGAGTCCATGCGAACT R：CCATGATCGGCTGCTTCAT Vimentin F：TGAGATTGCCACCTACAGGA R：GAGGGAGTGAATCCAGATTAGTTT E-cadherin F：TACACTGCCCAGGAGCCAGA R：TGGCACCAGTGTCCGGATTA S100A4 F：GTACTCGGGCAAAGAGGGTG R：TTGTCCCTGTTGCTGTCCAA β-actin F：CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC R：CGGACTCGTCATACTCCTGCT 1.2.10 蛋白质印迹（Western blot）分析
收集细胞总蛋白后，测定蛋白质浓度。随后，向蛋白质样品中加入上样缓冲液，并通过95℃水浴进行变性处理。利用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。随后将蛋白质转移至PVDF膜上。为减少非特异性结合，膜在5%的脱脂牛奶中封闭1 h。将膜与一抗ZEB1（1∶1 000）、ZEB2（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）、ERK（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、S100A4（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）在4℃摇床上慢摇孵育过夜。次日，用1×PBST洗涤膜后，将其与HRP偶联的抗兔IgG（稀释比例为1∶5 000）在室温下孵育1 h。再次洗涤后，使用ECL试剂对膜进行显影，以可视化目标蛋白的表达情况。使用凝胶图像分析系统5200 Multi（上海天能公司）读取目标条带的密度值，GAPDH用于一化进行数据分析。
1.2.11 2-NBDG检测葡萄糖摄取
使用荧光葡萄糖模拟物2-NBDG检测细胞对葡萄糖的摄取能力。将细胞接种于底部透光的96孔黑板中，贴壁过夜。饥饿处理24 h后，用PBS缓冲液轻柔清洗细胞1次，加入100 µM 的2-NBDG，37℃，孵育45 min。PBS轻柔清洗2遍，用酶标仪进行荧光［Ex （λ） 465 nm，Em （λ） 540 nm］的检测。
1.2.12 ELISA法检测细胞上清中L-乳酸含量
无血清处理细胞24 h后，离心（2 000 g，4℃，10 min）收集细胞上清液。取500 µL上清液，加入等体积预冷MPA（500 µL），充分涡旋混匀，冰上静置5 min。离心（10 000 g，4℃，5 min）使蛋白质成球。取出上清液，加入50 µL碳酸钾以中和酸。离心（10 000 g，4℃，5 min）以去除沉淀盐。取出上清液进行分析。使用96孔全黑板，每个孔中加20 µL样品，继续加入100 µL测定缓冲液、20 µL辅助因子混合物和20 µL荧光底物，最后加入40 µL酶混合物引发反应。在室温下避光孵20 min，在激发波长（530～540 nm）发射波长为（585～595 nm）读取荧光。
1.2.13 糖酵解速率检测
将探针板在无CO2的培养箱中用无菌水水化过夜。将含10 mM葡萄糖、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸盐的XF DMEM液在37℃无CO2培养箱中预热。用校准液替换水化板中的无菌水，并在37℃无CO2培养箱中孵育1 h。将2种细胞以8×103/孔的密度分别接种到XF96细胞培养微孔板中，贴壁过夜。经无血清培养液处理24 h后，用无酚红检测液替换细胞培养液，置于37℃无CO2培养箱中1 h。根据制造商的说明书添加鱼藤酮/抗霉素A（Rot/AA，线粒体电子传递链抑制剂）和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，糖酵解抑制剂）。上机检测细胞基础耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）、细胞外酸度（extracellular acidification rate，ECAR）和基础质子流速率（proton efflux rate，PER）。数据处理中用每孔细胞总蛋白量进行校正处理。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0、GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析。计量资料以（
$\bar x \pm s $ ）表示，组间采用t检验进行统计学分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 左心室注射MCF-7-BOM-luc细胞可形成骨转移
将MCF-7-luc和 MCF-7-BOM-luc细胞注射到裸鼠左心室，继续饲养4周。与MCF-7-luc组相比，MCF-7-BOM-luc荷瘤小鼠的股骨远端出现明显的荧光信号（图1A），股骨远端骨腔内的总体积（quantification of total volume，TV）提高，而骨小梁体积（trabecular bone volume，BV）、骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁数（trabecular number, Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）明显下降（图1B），并伴随着体重的减轻（图1C）。
![]()
图 1 左心室注射MCF-7-BOM-luc细胞可形成骨转移A：裸鼠活体成像图及荧光值分析；B：股骨远端Micro-CT图；C：体重；MCF-7-BOM-luc与MCF-7-luc相比，**：P<0.012.2 细胞迁移、侵袭和EMT指标的比较
亲本MCF-7-luc细胞呈多边形，MCF-7-BOM-luc细胞呈细长的条梭形。与MCF-7-luc细胞相比，MCF-7-BOM-luc细胞的迁移和侵袭力均显著提高（图2A、B）。EMT标志物（包括ZEB1、ZEB2和Vimentin）在MCF-7-BOM-luc中的蛋白和基因水平的表达均显著上调，而E-cadherin显著下调（图2C、D）。
![]()
图 2 细胞在增殖、迁移、侵袭和EMT指标的比较A：细胞迁移力检测；B：细胞侵袭力检测；C：EMT指标的蛋白表达；D：EMT指标的mRNA表达；*：P<0.05；**：P<0.012.3 差异蛋白的检测及验证
蛋白质组学的结果以倍数变化（fold change， FC）≥2或≤0.5，P<0.05为差异蛋白的遴选标准进行分析。与MCF-7-luc细胞相比，在骨转细胞中鉴定出495个差异蛋白，其中70个蛋白上调，425个蛋白下调。表2列出了FC提高或降低中排名前5位的差异蛋白，S100A4在表达提高的差异蛋白中FC排名第一。
表 2 差异蛋白部分列表（ $\bar x \pm s $ ）蛋白名称 全称 MCF-7-luc MCF-7-BOM-luc P FC S100A4 Protein S100-A4 13.23±2.40 186.77±42.73** 0.00 14.11 SPANXB1 Sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B1 15.83±3.56 184.13±103.56* 0.05 11.63 PTRHD1 Putative peptidyl-tRNA hydrolase PTRHD1 18.75±1.48 187.5±33.22** 0.01 10.00 UBAP2 Ubiquitin-associated protein 2 19.75±8.56 186.87±67.72* 0.05 9.46 CRELD2 Cysteine-rich with EGF-like domain protein 2 25.4±2.29 174.63±43.81 **0.00 6.88 KIAA1324 UPF0577 protein KIAA1324 190.33±0.16 9.67±3.27** 0.00 0.05 PARD3 Partitioning defective 3 homolog 280.2±0.24 13.23±3.00** 0.00 0.05 S100P Protein S100-P 194.17±0.29 8.8±0.99* 0.02 0.05 AGR2 Anterior gradient protein 2 homolog 193.07±0.10 6.93±2.25** 0.00 0.04 GFRA1 GDNF family receptor alpha-1 196.53±0.17 5.2±1.27** 0.00 0.03 *P<0.05；**P<0.01 利用Western blot方法考察差异蛋白S100A4的表达，S100A4在MCF-7-BOM-luc细胞中蛋白表达水平显著提高（图3A），与蛋白质组学检测结果的趋势一致。
通过免疫组织化学法检测荷瘤裸鼠中S100A4表达，结果显示与MCF-7-luc组裸鼠比，MCF-7-BOM-luc组裸鼠骨组织生长板附近S100A4阳性表达显著增加（图3B）。
2.4 信号通路分析和检测
差异蛋白的GO二级注释分析结果中生物进程（BP）主要涉及核糖体RNA转运、内质网到高尔基泡介导的运输、核糖体小亚基生物发生、鞘脂生物合成过程、三羧酸循环、线粒体ATP合成耦合质子传输；细胞组成主要为内质网膜、细胞外的外来体、线粒体、黑素体、细胞膜、内质网、细胞质基质等；分子功能主要为RNA结合、蛋白质结合、GTP 酶活性、三磷酸鸟苷结合、钙黏着蛋白结合、相同的蛋白质结合、信使RNA结合、腺苷三磷酸酶活性等。
KEGG的分析结果发现差异蛋白富集于代谢通路（表3）。肿瘤细胞展现出一种独特的能量代谢现象，即具有高糖吸收的能力，并且在有氧条件下仍然倾向于进行糖酵解，同时产生大量的乳酸[6]。与MCF-7-luc细胞相比，MCF-7-BOM-luc细胞对葡萄糖摄取能力提高1.9倍，细胞上清中的L-乳酸水平上调8.9倍，细胞基础耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）（图4A）、细胞外酸度（extracellular acidification rate，ECAR）（图4B）和基础质子流速率（basal proton efflux rate，PER）均提高，提示糖酵解速率的加剧（图4C）。
表 3 KEGG信号通路分析结果信号通路 差异蛋白数 富集指数 P 柠檬酸循环(TCA循环) 7 1.39 <0.01 内质网中的蛋白质加工 15 2.98 <0.01 吞噬体 14 2.78 <0.01 N-聚糖生物合成 8 1.59 <0.01 鞘脂类代谢 8 1.59 <0.01 真核生物中的核糖体生物发生 14 2.78 <0.01 溶酶体 12 2.39 <0.01 2-氧羧酸代谢 6 1.19 <0.01 囊泡运输中的SNARE相互作用 6 1.19 <0.01 代谢途径 67 13.32 <0.01 癌症的中心碳代谢 8 1.59 0.01 ![]()
图 4 肿瘤代谢糖酵解速率的检测A：MCF-7-LUC与MCF-7-BOM -LUC细胞基础耗氧率；B：MCF-7 -LUC与MCF-7-BOM -LUC细胞基础质子流速率；C：MCF-7- LUC与MCF-7-BOM -LUC细胞外酸度丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）[7]和信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路[8]调控S100A4的表达。Western blot结果发现与MCF-7-luc细胞相比，MCF-7-BOM-luc细胞中ERK1/2和STAT3的磷酸化水平显著提高，提示ERK1/2/MAPK信号通路和STAT3信号通路在骨转细胞中存在异常活化（图5A、B）。
3. 讨论
乳腺癌临床上常见的远端转移有骨、肺、脑等，其转移复发是导致死亡的主要原因。癌症转移是一个涉及多个阶段的复杂过程，首先，癌细胞从原发部位开始侵袭，通过淋巴系统或血管进入血液循环。在循环中存活的癌细胞传播到远处部位定植，形成继发性肿瘤。这一系列的步骤共同构成了癌症转移的全过程。深入了解和阐明乳腺癌选择性骨转移的蛋白特征及其分子机制可为乳腺癌骨转移的预防和治疗提供潜力干预靶点和新策略。
骨转移细胞亚系MCF-7-BOM来源于亲本乳腺癌细胞MCF-7，通过多次动物实验分离纯化骨转移灶中的MCF-7细胞而得[9]。
本研究体内外的功能实验的结果表明，MCF-7-BOM较亲本MCF-7细胞有更强的细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和骨骼转移的恶性表型。使用蛋白质组学技术结合生信分析比较亲本和骨转亚系细胞，发现差异蛋白S100A4及代谢通路是骨转移性乳腺癌细胞的蛋白表达特征。
S100A4以EF手性基序为特征，参与细胞增殖、分化、代谢、黏附、血管生成和信号转导等多项生理功能[10]，也是参与肿瘤转移的钙结合蛋白 S100 家族的成员，又称为肿瘤转移因子（metastasin），通过调节细胞内的细胞骨架动力学和加速细胞迁移、侵袭和血管生成促进侵袭性转移[11]。乳腺癌[12]、宫颈癌[13]、前列腺癌[14]、胃癌[15]、非小细胞肺癌[16]等多种癌症患者的免疫组织化学分析结果均显示S100A4的高表达。动物实验结果表明，在乳腺癌动物模型中，肿瘤细胞过表达S100A4可促进侵袭性转移表型[17]。本研究结果显示S100A4在骨转移性乳腺癌细胞中表达提高。尽管S100A4已被确定为乳腺癌转移的诱导因子和不良预后的生物标记物[18]，但其导致癌症侵袭性增加的具体机制尚未阐明。
糖酵解与氧化磷酸化是细胞进行能量代谢的主要途径。肿瘤细胞中存在瓦博格（Warburg）效应，即使氧气充足也依然依靠糖酵解供能[19]。糖酵解是指细胞内将葡萄糖分子转化为两个丙酮酸分子，并产生两个三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）分子的生物化学过程。丙酮酸是一种代谢中间体，可以通过乳酸脱氢酶在细胞质基质中转化为乳酸[20]。糖酵解已成为肿瘤生物学及代谢领域的研究热点。本研究中蛋白质组学差异蛋白的KEGG分析显示富集通路为代谢通路。因此，检测了2种细胞在糖酵解进程中葡萄糖摄取、糖酵解速率和L-乳酸产量，发现MCF-7-BOM-luc细胞对葡萄糖摄取能力提高，ECAR和PER上调，最终形成更多乳酸，代谢表型是依赖糖酵解。
S100A4的表达受MAPK和STAT3信号通路的调控[7-8]。MAPKs是参与调节多种细胞过程（包括增殖、分化、细胞凋亡和应激反应）的信号级联反应的激酶[21]，其中ERK1/2信号通路在促进细胞增殖和侵袭上多有报道[22]。在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）患者的临床数据显示ERK激活、ERK水平与较短的生存期有关[23]。ERK和p-ERK水平与肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移有关[24]，表明该信号通路的异常激活与增殖提高及侵袭性特征相关。此外，失活ERK1/2信号通路下调S100A4的表达，可抑制人宫颈癌细胞迁移和侵袭[25]。STAT3信号通路与癌症的发生、进展、转移、化疗耐药和免疫逃逸密切相关[26]。磷酸化STAT3通过其磷酸化Tyr705位点与SH2结构域的相互作用，触发STAT3二聚体从细胞表面受体的解离，以及从细胞质到细胞核的易位[27]，细胞核STAT3结合特定DNA序列，激活转录调节癌细胞的多种促癌基因[28]。TNBC发生发展的关键进程中均发现STAT3的异常激活[29-30]。外泌体中的S100A4 通过激活 STAT3 诱导免疫抑制并促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭[31]。ERK信号通路还介导了S100A4诱导的成纤维细胞活化[32]，TGF-β1 通过 ERK1/2 信号调节 S100A4，促进乳腺癌细胞的侵袭、迁移和血管生成[33]。ZEB1 与 IL-6/11-STAT3 协同作用，上调 S100A4促进胰腺癌细胞侵袭[34]。通过下调 AMPK-STAT3 轴下调 S100A4 表达可防止 TGF-β1 诱导的成纤维细胞活化[35]。上述研究均表明在多种肿瘤的侵袭迁移过程中，S100A4的表达与ERK及STAT3信号通路的活化紧密相关。
本研究结果表明乳腺癌骨转细胞亚系MCF-7-BOM-luc 中ERK1/2和STAT3蛋白的磷酸化水平显著提高，提示存在ERK1/2和STAT3信号通路的活化，导致S100A4的表达提升。
综上，MCF-7-BOM-luc细胞具有骨转移恶性，部分通过活化ERK1/2和STAT3信号通路上调S100A4的表达以促进EMT和糖酵解。S100A4可能是骨转移的潜力靶点，研究结果为靶向S100A4治疗骨转移性乳腺癌提供实验依据。
-
![]()
图 1 左心室注射MCF-7-BOM-luc细胞可形成骨转移
A：裸鼠活体成像图及荧光值分析；B：股骨远端Micro-CT图；C：体重；MCF-7-BOM-luc与MCF-7-luc相比，**：P<0.01
![]()
图 2 细胞在增殖、迁移、侵袭和EMT指标的比较
A：细胞迁移力检测；B：细胞侵袭力检测；C：EMT指标的蛋白表达；D：EMT指标的mRNA表达；*：P<0.05；**：P<0.01
![]()
图 4 肿瘤代谢糖酵解速率的检测
A：MCF-7-LUC与MCF-7-BOM -LUC细胞基础耗氧率；B：MCF-7 -LUC与MCF-7-BOM -LUC细胞基础质子流速率；C：MCF-7- LUC与MCF-7-BOM -LUC细胞外酸度
表 1 qPCR引物序列
基因名称 引物序列（5'～3'） ZEB1 F：TGTTACCAGGGAGGAGCAGT R：TGCCCTTCCTTTCCTGTGT ZEB2 F：GCCGAGTCCATGCGAACT R：CCATGATCGGCTGCTTCAT Vimentin F：TGAGATTGCCACCTACAGGA R：GAGGGAGTGAATCCAGATTAGTTT E-cadherin F：TACACTGCCCAGGAGCCAGA R：TGGCACCAGTGTCCGGATTA S100A4 F：GTACTCGGGCAAAGAGGGTG R：TTGTCCCTGTTGCTGTCCAA β-actin F：CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC R：CGGACTCGTCATACTCCTGCT 
下载: 导出CSV
表 2 差异蛋白部分列表
（ $\bar x \pm s $ ）蛋白名称 全称 MCF-7-luc MCF-7-BOM-luc P FC S100A4 Protein S100-A4 13.23±2.40 186.77±42.73** 0.00 14.11 SPANXB1 Sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B1 15.83±3.56 184.13±103.56* 0.05 11.63 PTRHD1 Putative peptidyl-tRNA hydrolase PTRHD1 18.75±1.48 187.5±33.22** 0.01 10.00 UBAP2 Ubiquitin-associated protein 2 19.75±8.56 186.87±67.72* 0.05 9.46 CRELD2 Cysteine-rich with EGF-like domain protein 2 25.4±2.29 174.63±43.81 **0.00 6.88 KIAA1324 UPF0577 protein KIAA1324 190.33±0.16 9.67±3.27** 0.00 0.05 PARD3 Partitioning defective 3 homolog 280.2±0.24 13.23±3.00** 0.00 0.05 S100P Protein S100-P 194.17±0.29 8.8±0.99* 0.02 0.05 AGR2 Anterior gradient protein 2 homolog 193.07±0.10 6.93±2.25** 0.00 0.04 GFRA1 GDNF family receptor alpha-1 196.53±0.17 5.2±1.27** 0.00 0.03 *P<0.05；**P<0.01
下载: 导出CSV
表 3 KEGG信号通路分析结果
信号通路 差异蛋白数 富集指数 P 柠檬酸循环(TCA循环) 7 1.39 <0.01 内质网中的蛋白质加工 15 2.98 <0.01 吞噬体 14 2.78 <0.01 N-聚糖生物合成 8 1.59 <0.01 鞘脂类代谢 8 1.59 <0.01 真核生物中的核糖体生物发生 14 2.78 <0.01 溶酶体 12 2.39 <0.01 2-氧羧酸代谢 6 1.19 <0.01 囊泡运输中的SNARE相互作用 6 1.19 <0.01 代谢途径 67 13.32 <0.01 癌症的中心碳代谢 8 1.59 0.01
下载: 导出CSV
-
[1] Giaquinto AN, Sung H, Miller KD, et al. Breast cancer statistics, 2022[J]. CA Cancer J Clin, 2022, 72(6):524-541. DOI: 10.3322/caac.21754
[2] Wu Q, Li J, Zhu S, et al. Breast cancer subtypes predict the preferential site of distant metastases: a SEER based study[J]. OncoTargets Ther, 2017, 8(17):27990-27996. DOI: 10.18632/oncotarget.15856
[3] Xu D, Tang M. Advances in the study of biomarkers related to bone metastasis in breast cancer[J]. Br J Radiol, 2023, 96(1150):20230117. DOI: 10.1259/bjr.20230117
[4] Zarrer J, Haider MT, Smit DJ, et al. Pathological crosstalk between metastatic breast cancer cells and the bone microenvironment[J]. Biomolecules, 2020, 10(2):337.
[5] Christ AB, Piple AS, Gettleman BS, et al. Prevalence of primary malignant tumours, rates of pathological fracture, and mortality in the setting of metastatic bone disease[J]. Bone Jt Open, 2023, 4(6):424-431. DOI: 10.1302/2633-1462.46.BJO-2023-0042.R1
[6] Liu G, Song G. Regulation of tumor cell glycometabolism and tumor therapy][J]. J Biomed Eng, 2019, 36(4):691-695.
[7] Liu A, Li Y, Lu S, et al. Stanniocalcin 1 promotes lung metastasis of breast cancer by enhancing EGFR-ERK-S100A4 signaling[J]. Cell Death Dis, 2023, 14(7):395. DOI: 10.1038/s41419-023-05911-z
[8] Sun H, Wang C, Hu B, et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3[J]. Signal Transduct Target Ther, 2021, 6(1):187. DOI: 10.1038/s41392-021-00579-3
[9] Kang Y, He W, Tulley S, et al. Breast cancer bone metastasis mediated by the Smad tumor suppressor pathway[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(39):13909-13914. DOI: 10.1073/pnas.0506517102
[10] Chen N, Sato D, Saiki Y, et al. S100A4 is frequently overexpressed in lung cancer cells and promotes cell growth and cell motility[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 447(3):459-464. DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.04.025
[11] Wu Y, Li H, Qin Y. S100A4 promotes the progression of lipopolysaccharide-induced acute epididymitis in mice[J]. Biol Reprod, 2020, 102(6):1213-1224. DOI: 10.1093/biolre/ioaa022
[12] Xu Y, Li X, Zhang S, et al. CircMMP2(6,7) cooperates with β-Catenin and PRMT5 to disrupt bone homeostasis and promote breast cancer bone metastasis[J]. Cancer Res, 2024, 84(2):328-343. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1899
[13] Bueno-Urquiza LJ, Godínez-Rubí M, Villegas-Pineda JC, et al. Phenotypic heterogeneity of cancer associated fibroblasts in cervical cancer progression: FAP as a central activation marker[J]. Cells, 2024, 13(7):560. DOI: 10.3390/cells13070560
[14] Yang L, Liu J, Yin J, et al. S100A4 modulates cell proliferation, apoptosis and fibrosis in the hyperplastic prostate[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2024, 169:106551. DOI: 10.1016/j.biocel.2024.106551
[15] Liu S, Zhang Z, Jiang L, et al. Claudin-18.2 mediated interaction of gastric cancer cells and cancer-associated fibroblasts drives tumor progression[J]. Cell Commun Signal, 2024, 22(1):27. DOI: 10.1186/s12964-023-01406-8
[16] Rud AK, Lund-Iversen M, Berge G, et al. Expression of S100A4, ephrin-A1 and osteopontin in non-small cell lung cancer[J]. BMC Cancer, 2012, 12:333. DOI: 10.1186/1471-2407-12-333
[17] Bresnick AR. S100 proteins as therapeutic targets[J]. Biophys Rev, 2018, 10(6):1617-1629. DOI: 10.1007/s12551-018-0471-y
[18] Andersen K, Mori H, Fata J, et al. The metastasis-promoting protein S100A4 regulates mammary branching morphogenesis[J]. Dev Biol, 2011, 352(2):181-190. DOI: 10.1016/j.ydbio.2010.12.033
[19] Warburg O, Wind F, Negelein E. The metabolism of tumors in the body[J]. J Gen Physiol, 1927, 8(6):519-530.
[20] TeSlaa T, Teitell MA. Techniques to monitor glycolysis[J]. Methods Enzymol, 2014, 542:91-114.
[21] Guo YJ, Pan WW, Liu SB, et al. ERK/MAPK signalling pathway and tumorigenesis[J]. Exp Ther Med, 2020, 19(3):1997-2007.
[22] Lee S, Rauch J, Kolch W. Targeting MAPK signaling in cancer: mechanisms of drug resistance and sensitivity[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(3):1102. DOI: 10.3390/ijms21031102
[23] Bartholomeusz C, Gonzalez-Angulo AM, Liu P, et al. High ERK protein expression levels correlate with shorter survival in triple-negative breast cancer patients[J]. Oncologist, 2012, 17(6):766-774. DOI: 10.1634/theoncologist.2011-0377
[24] Shao GL, Wang MC, Fan XL, et al. Correlation between Raf/MEK/ERK signaling pathway and clinicopathological features and prognosis for patients with breast cancer having axillary lymph node metastasis[J]. Technol Cancer Res Treat, 2018, 17:1533034617754024.
[25] Hsin MC, Hsiao YH, Chen PN, et al. Dihydromyricetin inhibited migration and invasion by reducing S100A4 expression through ERK1/2/β-Catenin pathway in human cervical cancer cell lines[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(23):15106. DOI: 10.3390/ijms232315106
[26] Qin JJ, Yan L, Zhang J, et al. STAT3 as a potential therapeutic target in triple negative breast cancer: a systematic review[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2019, 38(1):195. DOI: 10.1186/s13046-019-1206-z
[27] Wang Y, Shen Y, Wang S, et al. The role of STAT3 in leading the crosstalk between human cancers and the immune system[J]. Cancer Lett, 2018, 415:117-128. DOI: 10.1016/j.canlet.2017.12.003
[28] Yu H, Lee H, Herrmann A, et al. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions[J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14(11):736-746. DOI: 10.1038/nrc3818
[29] Marotta LL, Almendro V, Marusyk A, et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44⁺CD24⁻ stem cell-like breast cancer cells in human tumors[J]. J Clin Invest, 2011, 121(7):2723-2735. DOI: 10.1172/JCI44745
[30] Sirkisoon SR, Carpenter RL, Rimkus T, et al. Interaction between STAT3 and GLI1/tGLI1 oncogenic transcription factors promotes the aggressiveness of triple-negative breast cancers and HER2-enriched breast cancer[J]. Oncogene, 2018, 37(19):2502-2514. DOI: 10.1038/s41388-018-0132-4
[31] Wu X, Zhang H, Jiang G, et al. Exosome-transmitted S100A4 induces immunosuppression and non-small cell lung cancer development by activating STAT3[J]. Clin Exp Immunol, 2022, 210(3):309-320. DOI: 10.1093/cei/uxac102
[32] Qi Y, Zhao T, Li R, et al. Macrophage-secreted S100A4 supports breast cancer metastasis by remodeling the extracellular matrix in the premetastatic niche[J]. Biomed Res Int, 2022, 2022:9895504.
[33] Wang XG, Meng Q, Qi FM, et al. Blocking TGF-β inhibits breast cancer cell invasiveness via ERK/S100A4 signal[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(24):3844-3853.
[34] Al-Ismaeel Q, Neal CP, Al-Mahmoodi H, et al. ZEB1 and IL-6/11-STAT3 signalling cooperate to define invasive potential of pancreatic cancer cells via differential regulation of the expression of S100 proteins[J]. Br J Cancer, 2019, 121(1):65-75. DOI: 10.1038/s41416-019-0483-9
[35] Ji H, Dong H, Lan Y, et al. Metformin attenuates fibroblast activation during pulmonary fibrosis by targeting S100A4 via AMPK-STAT3 axis[J]. Front Pharmacol, 2023, 14:1089812. DOI: 10.3389/fphar.2023.1089812
计量
- 文章访问数: 69
- HTML全文浏览量: 20
- PDF下载量: 17
