胃癌是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一, 据WHO全球常见肿瘤评估报告指出, 每年有93.4万新发胃癌病例, 约70万人死于胃癌, 其死亡率居第2位^[1]。我国2006年第3次全国死因回顾抽样调查结果显示男性和女性胃癌死亡率分别居男性恶性肿瘤死因顺位第3位和女性恶性肿瘤死因顺位第2位^[2]。Hp(Helicobacter pylori, Hp)作为胃癌发生的始动因子, 被证明与胃癌的发生、发展密不可分。研究发现Hp的感染能引起胃黏膜细胞炎性改变, 其分泌的多种毒力因子加剧细胞损伤, 促进其恶性增殖, 引起慢性炎症向肿瘤的转变, 其毒素相关蛋白A(cytotoxin associated protein A, CagA)作为其重要致病因子而被广泛关注^[3-7]。运用蛋白质组学的方法在Hp处理的胃癌细胞中发现氯离子通道蛋白(Chloride ion channel protein, CICP)和β-肌动蛋内(β-actin)是其差异表达蛋白, 推测它们的差异表达与Hp感染相关, 可能参与其致病性。因此, 本研究检测了这二个差异表达蛋白的基因在人胃癌组织的表达, 并分析其表达与临床病理特征和Hp感染的关系, 为研究Hp促进胃癌发生、发展的机制提供新的线索。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   标本

收集2005年1月至2009年12月在贵阳医学院附属肿瘤医院行胃癌根治术切除并经病理检查确诊的50例组织标本(含癌旁组织、胃癌组织及淋巴结组织), 其中男性35例, 女性15例; 年龄36~79岁, 中位年龄61岁。根据国际抗癌联盟(UICC)2002年公布的胃癌pTNM分期, Ⅰ期2例, Ⅱ期10例, Ⅲ期17例, Ⅳ期21例。其中淋巴结转移30例, 无淋巴结转移20例。行根治术后电话随访7~59个月, 达到2年生存期23例, 死亡27例。本研究得到了患者的知情同意及医院伦理委员会批准。

1.1.2   试剂与仪器

Trizol购自美国Invitrogen公司, Oligo dT18及dNTPs购自上海生工生物工程有限公司, SYBR Green Mix购自美国ABI公司, MMV逆转录酶、RNA酶抑制剂购自美国Promega公司, SYBR Green QPCR Master Mix购自美国ABI公司, Step-one plus型实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

1.2   方法

1.2.1   目的基因的检测

使用Trizol一步法分别提取癌旁组织、胃癌组织及淋巴结组织的总RNA, 逆转录成cDNA。以各组织cDNA为模版, 在ABI Step-one plus型实时荧光定量PCR仪上检测CICP和β-actin基因的表达, 采用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase 1, HPRT1)作为内参基因, 实验中所有使用的引物序列见表 1。反应条件如下: 95℃10 min, 95℃15s, 60℃1 min, 共40个循环。将各目的基因的荧光信号进行收集、分析, 以HPRT1为内参基因、以癌旁组织为对照计算各目的基因相对表达量2^-ΔΔCtΔΔCt=(Ct_目的基因-Ct_HPRT1)处理组-(Ct_{目的基因-}Ct_HPRT1)对照组, 用熔解曲线监测各样本PCR反应的特异性, 用相对标准曲线计算PCR反应的扩增效率。

表  1  PCR引物序列

Table  1.  The primer sequences in this study

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.2.2   胃癌组织中Hp感染的检测

用微量法提取胃癌组织DNA, 以组织DNA为模板, 用PCR法扩增Hp的16s rRNA基因, 并进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3   统计学方法

多样本比较采用SPSS 13.0软件的单因素方差分析, 两样本比较用独立t检验, P < 0.05为有显著性差异。

2.   结果

2.1   CICP和β-actin基因在人胃癌组织中表达

结果显示每个样本的熔解曲线均为单峰, 基因的扩增效率在90%~109%, 相对表达量见表 2。

表  2  氯离子通道蛋白基因和β-肌动蛋白基因在人胃癌组织中的表达  （x±s）

Table  2.  The expression of Chloride ion channel protein and β-actin genes in human gastric cancer tissue

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2   人胃癌组织中Hp感染的检测

PCR扩增结果显示, 人胃癌组织中Hp感染的阳性率为68%(34/50)。

2.3   人胃癌组织中Hp的感染与CICP和β-actin基因表达的关系

将胃癌组织中CICP和β-actin基因的表达与其Hp感染状态进行分析, 结果见表 3。

表  3  目的基因的表达与胃癌组织Hp感染的关系  （x±s）

Table  3.  The relationship of the expression of Chloride ion channel protein and β-actin genes with Hp infection in gastric cancer tissue

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   人胃癌组织中CICP和β-actin基因的表达与临床病理参数的关系

将胃癌组织中CICP和β-actin基因的相对表达量与临床病理参数进行分析, 结果显示CICP基因的表达与pTNM分期及生存时间相关, 而β-actin基因的表达与pTNM分期及淋巴结转移相关(表 4)。

表  4  目的基因的表达与临床病理特征的关系

Table  4.  The relationship of the expression of Chloride ion channel protein and β-actin genes with the clinicopathologic features

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

Hp是胃癌发生的始动因子, 大量研究证实Hp能通过调控细胞生长和分化相关的信号通路以及分泌大量致病因子引起炎症反应, 加重胃黏膜损伤, 从而促进慢性胃炎的转化而致癌变。CICP是一类分布于生物体细胞膜及细胞器膜的跨膜蛋白, 广泛存在于神经细胞、血管平滑肌细胞及分泌腺体的组织器官中, 参与细胞电位、细胞的增殖分化及凋亡等多种病理生理过程。有研究发现CICP能稳定骨骼肌膜电位、调节内涵体和突触小泡的酸化、细胞容积和胞内定位, 且可能在肿瘤发生、演进、调节细胞周期及促进肿瘤细胞侵袭转移等恶性生物学行为方面有重要作用^{[8, 9]}。Li等^{[10, 11]}的研究提示CICP有助于卵巢癌细胞的增值, 并增加其侵袭转移能力, 使用其抑制剂可以阻滞细胞周期的进展和降低其侵袭力。有研究也证实CICP在多种肿瘤细胞中异常表达, 从而推测其可能与肿瘤增殖、侵袭等有关^{[12, 13]}。本实验结果显示胃癌及淋巴结组织中CICP基因的表达明显升高(P < 0.01), 且与Hp感染阴性的组织相比, Hp感染阳性的胃癌组织中CICP基因的表达上调了3.16倍(P < 0.01), 因此推测Hp可能通过影响CICP基因的表达在胃癌的增殖过程中发挥一定作用。

肌动蛋白是肌纤维和真核细胞骨架中微丝的主要蛋白质, 由374个氨基酸残基组成, 约占细胞总蛋白质的5%~10%, 分为α、β、γ3种类型。正常情况下β-actin在细胞内有维持细胞结构、运动及分裂等方面的作用。研究发现在多种疾病中β-actin基因表达异常^{[14, 15]}, 但是在肿瘤中是否有差异表达, 笔者尚未见相关报道。本实验结果显示在胃癌组织及淋巴结组织中β-actin基因的表达量显著升高(P < 0.01), 并且与胃癌组织中Hp的感染相关, 由此推测Hp感染上调胃癌组织中β-actin基因的表达在肿瘤细胞的运动及分裂中可能发挥重要作用。

本研究还初步分析了CICP和β-actin基因的表达与胃癌患者病理参数的关系, 结果显示CICP基因的高表达与更为恶性的pTNM分期及更短的生存时间相关(P < 0.05), 而β-actin基因的高表达也与pTNM分期及淋巴结转移相关(P < 0.05)。提示联合检测胃癌组织中CICP和β-actin基因的表达也许对判断患者预后有一定作用。此外, 本结果还发现虽然CICP和β-actin基因的表达在胃癌组织和淋巴结组织中均有增加, 但是在胃癌组织中的表达高于淋巴结组织, 推测可能与胃癌组织中存在Hp的长期感染相关, 并且淋巴结组织中有13例病理检测未见癌转移, 这些因素可能是淋巴结组织中的表达量低于胃癌组织的原因之一。

总之, CICP和β-actin基因在胃癌组织中的表达显著升高, 并与胃癌组织中Hp的感染相关, 且两个基因的高表达与胃癌pTNM分期、生成时间及淋巴结转移等患者的预后参数相关, 因此深入研究其高表达机制对于研究Hp与胃癌演变的关系和判断患者的预后有重要意义。