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摘要:目的 研究黑色素瘤特异性抗原（preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME）基因在急性白血病中的表达及其临床意义。方法 应用逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）技术，检测自2009年5月到2010年5月收治的34例急性白血病患者和12例健康者骨髓单核细胞中PRAME基因的mRNA表达水平，并与患者临床资料行相关性分析。结果 34例急性白血病患者中，PRAME基因表达率为38.2%（13/34），AML患者PRAME的阳性表达率为40.7%（11/27），ALL患者的阳性表达率为28.6%（2/ 7）。在AML各亚型中，M3型阳性率最高为80%，其次为M2（33.3%）和M5（28.6%）。分别行PRAME基因阳性与阴性组细胞表面抗原的监测，两组CD15（P < 0.05）及CD33（P < 0.05）的表达率均有显著性差异。染色体核型异常患者PRAME阳性率为61.5%（8/ 13），明显高于染色体核型正常者28.6%（4/14）（P < 0.05）；患者的年龄、性别、白细胞数、骨髓中原始和幼稚细胞比例与PRAME基因mRNA的表达差异无统计学意义。结论 PRAME基因在急性白血病中表达率较高，可作为监测微小残留病（minimal residual disease，MRD）的标志基因之一。PRAME有可能作为白血病特异性免疫治疗的靶抗原。Abstract:Objective To investigate the expression of the preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) gene in acute leukemia and its clinical significance.Methods The mRNA expression of the PRAME gene in bone marrow mononuclear cells was measured via reverse transcriptase polymerase chain reaction in 34 acute leukemia (AL) patients (admitted between May 2009 and May 2010) and 12 bone marrow samples from healthy donors. The correlation between the expression of PRAME and the clinical characteristics of leukemia patients was analyzed.Results The PRAME gene was expressed in 38.2% of 34 patients (13/34), 40.7% (11/27) of acute myeloid leukemia (AML) patients, and 28.6% (2/7) of acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients, but not in the healthy donors. The expressive difference between AML and ALL patients had statistical significance. The gene expression was in 80% M3, 33.3% M2, and 28.6% M5. The expression was also correlated with CD15 and CD33 expression and abnormal karyotype (8/13), but not with age, gender, white blood count, or blast percentage.Conclusion The PRAME gene is highly expressed of acute leukemia, and could be a useful parameter for monitoring MRD. It is a potential target for immunotherapy of acute leukemia.
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PRAME基因是由Ikeda等[1]于1997年首次在1例黑色素瘤患者的瘤组织中分离出来并证明能被细胞毒性T细胞（CTL）识别的肿瘤抗原，该基因位于人类染色体22q11上，编码含509个氨基酸的蛋白质，主要通过HLA-24识别而被呈递给CTL细胞。在正常睾丸、肾上腺、卵巢和子宫内膜组织中[2]PRAME基因表达较低，低于肿瘤组织3个数量级以上。国外研究表明，该基因在白血病细胞中高表达[3]，与白血病缓解和复发有明显关系[4]，早期监测骨髓细胞PRAME基因的表达可判断对化疗的反应及有无耐药性[2]。本研究应用RT-PCR方法研究PRAME mRNA在各类成人急性白血病中的表达规律，并与患者临床资料行相关性分析，为临床监测微小残留病（MRD）及进一步对白血病的免疫治疗提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象
天津医科大学总医院血液科2009年5月至2010年5月收治的急性白血病患者34例。初诊24例，缓解10例。男性15例，女性19例，中位年龄42.5（9~72）岁。急性髓系白血病（AML）27例，其中M2型12例（初治8例，缓解4例），M3型5例（初治1例，缓解4例），M5型7例（初治6例，缓解1例），M4Eo1例。急性淋巴细胞白血病（ALL）7例，其中儿童3例，成人4例。所有诊断、分型均符合FAB标准。正常对照12例。
1.1.2 实验试剂
溶血素（lysing solution）购自BD公司，经典总RNA提取试剂盒（classical total RNA isola⁃ tion kit）购自上海生工生物科技公司，cDNA合成试剂盒（mmlv first strand cDNA synthesis kit）购自上海生工生物科技公司，PCR合成试剂盒（ready-to-use PCR kit）购自上海生工生物科技公司。
1.2 研究方法
1.2.1 单个核细胞的提取
取2%EDTA抗凝骨髓1 mL，使用溶血素溶解红细胞后提取骨髓单个核细胞，PBS洗涤3遍。
1.2.2 总RNA的提取及鉴定
裂解细胞后，使用氯仿/异戊醇法萃取总RNA。吸光度扫描计算总RNA浓度并估算其纯度，波长260 nm与280 nm处的吸光度（A）比值1.8~2.0为合格。
1.2.3 RT-PCR
1）引物序列：PRAME上游引物为5'-CTGTACTCATTTCCAGAGCCAGA-3'，下游引物为5'-TATTGAGAGGGTTTCCAAGGGGTT-3'，扩增片断长度561 bp。2）逆转录反应：取总RNA 1~5 μg，加入DDH2O 11 μL，Oligo-p（dT）18 1 μL，5×reaction buf⁃ fer 4 μL，RNase inhibitor（20 U/μL）1 μL，dNTP混合物2 μL，M-MuLV逆转录酶1 μL后整个反应体系达20 μL，37℃孵育60 min。放入水浴锅中70℃水浴10 min以中止反应。3）PCR扩增：取cDNA 1 μL，加入2×PCR Master 25 μL，ddH2O 22 μL，分别加入上游及下游引物1 μL。以β-actin作为内参。扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，64℃50 s，70℃ 1 min，34个循环。4）PCR产物分析：在2.5%琼脂糖凝胶中120V下电泳30min，在紫外灯下观察并摄像。
1.3 统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件包，采取单因素方差分析，方差齐性分析，两样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 实验结果
2.1 急性白血病患者PRAME基因的表达
见表 1。34例急性白血病中，PRAME基因阳性率为38.2%（13/34）（图 1）。AML的表达阳性率为40.7%（11/27），在所有初治的AML中，PRAME基因的表达率为38.9%（7/18）。ALL的表达率为28.6%（2/7），AML的表达率高于ALL（P>0.05）。
表 1 PRAME表达阳性的ALL患者一般情况Table 1. Expression of PRAME in ALL patients
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图 1 PRAME基因mRNA表达的电泳图M：Marker；1：M2；2：M3；3：ALL；4：β-actin；5：阴性对照Figure 1. Electrophoretic pattern of PRAME mRNA2.2 PRAME基因的表达与各临床指标之间的关系
在各种临床相关指标中，PRAME基因表达与性别、发病时白细胞数及年龄无明显相关性。本实验所涉及的各型急性白血病中，粒系来源的患者（M2、M3型）其PRAME基因的阳性率明显高于单核细胞来源（M5型）及淋巴细胞来源的患者（P < 0.05），且M3型的表达率80.0%（4/5）高于M2型33.3%（4/12）。在17例粒系白血病（M2+M3型）中，9例初治患者4例为阳性，8例缓解患者4例为阳性，二者差异无统计学意义。本实验对比了PRAME基因的表达与发病时骨髓中原始细胞数或者原始细胞+早幼细胞数的关系，发现其无明显相关性。同时使用流式细胞术检测急性白血病患者细胞表面特异性抗原，包括：CD3、CD5、CD7、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD33、CD34、CD64、CD117。按PRAME阳性及阴性对患者分组，然后计算每组各种抗原表达荧光强度的均数。结果发现，PRAME阳性组与PRAME阴性组CD15及CD33的表达率均有显著性差异（表 2，3）。
表 2 PRAME基因表达与CD15的关系%（x±s） Table 2. Relationship between PRAME gene expression and CD15
表 3 PRAME基因表达与CD33的关系%（x±s） Table 3. Relationship between PRAME gene expression and CD33
本实验34例急性白血病患者中，共有27例行染色体检查，其中13例存在染色体异常，包括移位缺失等。在12例正常对照中，有4例行染色体检查未见异常。存在染色体异常患者PRAME基因的表达明显增高（表 4）。
表 4 PRAME基因表达与染色体核型异常的关系例 Table 4. Relationship between PRAME gene expression and karyotypic abnormality
2.3 随访
本研究中1例成人ALL患者首疗程化疗后随着形态学缓解，PRAME基因转阴。而另1例形态学持续缓解的患者其PRAME基因由阴性转为阳性，提示该患者存在近期复发的可能，3个月后通过流式细胞仪可检测到少量原始细胞团，5个月后该患者形态学复发。
3. 讨论
目前临床判断急性白血病缓解的标准是症状、体征消失，血象正常，骨髓细胞计数中原始和幼稚细胞 < 5%。但此时体内仍存在常规显微镜未能检测到的白血病细胞即MRD，这也是患者复发的根源。如何在疾病早期或CR后及时检测到肿瘤细胞并予以彻底消灭，将是治疗白血病的关键。使用PCR的方法检测MRD敏感度可达10-4~10-6，明显优于流式细胞术和FISH等方法。但是，由于具有特异性基因标志（如PML/RARa、AML1/ETO、bcr/abl等）的白血病发病率较低，使PCR技术在MRD检测上受到一定限制。因此，寻找一种广泛表达的特异性靶抗原，将是疾病早期诊断、MRD监测及行进一步免疫治疗的前提。
本研究应用RT-PCR方法检测了34例急性白血病患者和12例健康者骨髓PRAME基因的表达，研究结果，基因的表达高于Paydas等[4]和van Baren等[5]的实验结果，而低于Steinbach等[6]的结论，可能是前两者针对成人急性白血病患者进行研究，而后者只研究了儿童急性白血病的病例。而本实验组34例急性白血病患者中既有成人也有儿童，未排除年龄对结果的影响。在AML各亚型中，M3型阳性率最高（80.0%），其次为M2型（33.3%）和M5型（28.6%），这与van Baren和Paydas的实验结果相同。本实验在12例健康者骨髓中未发现PRAME基因的表达，这与上述的研究结果一致。并且，本研究总结了所有34例急性白血病的其他相关临床资料，证明了PRAME基因的表达与患者年龄、性别、初诊时白细胞计数、骨髓中原幼细胞比例无关。
多项研究表明，PRAME阳性表达与染色体异位常存在着一定的关系[5, 7]，本研究中，对27例患者进行了染色体检查，证明染色体的异常的确与PRAME基因的表达相关，但PRAME基因是否与某种或某几种染色体核型异常有特别的对应关系，还有待进一步研究。另外，本研究对全部34例急性白血病患者进行了细胞表面抗原检测，其结果发现PRAME表达与CD15及CD33的表达率均有显著性相关。这与Paydas等[4]的研究结果相符。
相比于同类的WT1（Wilm's tumor）基因，PRAME基因作为又一种泛白血病基因，在无特异性核型的白血病中有更为广泛的表达[2]，且可检测到的白血病细胞滴度更低，可达10-4以下。而且，在某些疾病中，PRAME转阴晚于或转阳早于WT1基因。因此，PRAME在监测MRD上与WT1基因相比有相同或更高的价值[8]。有趣的是，本研究通过监测1例患者PRAME基因的动态变化监测到了其MRD的存在，较流式细胞学提前3个月，较形态学复发提前5个月，很好的例证了PRAME基因用于MRD监测的优越性。通过对PRAME基因mRNA定量，可为白血病患者提供个体化化疗，其表达水平下降至健康者范围可暂不予化疗，而迅速提高提示需尽快选择合适的化疗方案，而不是目前CR患者所使用的统一的化疗方案。
本研究证明了PRAME在伴有染色体异常的白血病中高表达。而染色体异常往往伴有融合基因的产生，融合蛋白往往参与细胞内异常信号传导。因此推测，PRAME可能在细胞增殖过程中参与细胞内信号传导。有研究证明PRAME是RARa途径的抑制者[9]，在维甲酸（retinoic acid，RA）的存在下，PRAME与RAR结合从而阻止了配体介导的受体激活，进而通过趋化Polycomb蛋白而阻止了RARE（RAR ele⁃ ment）向下游启动转录，也就是阻止了细胞分化和调亡。近期研究表明：PRAME蛋白是Cul2泛素连接酶的一个亚基，参与核因子Y启动子的激活[10]。
PRAME用于免疫治疗的前景也颇为广阔，作为一种细胞膜蛋白并能被HLA-24呈递的CTL识别，进而造成细胞被CTL溶解。可以从黑色素瘤患者中提取出PRAME特异性的CTL，更为重要的是，PRAME蛋白在人体正常组织中呈低度表达或者不表达，且在CD34+细胞中也未发现PRAME mRNA的表达[11]，提示PRAME有成为肿瘤疫苗研制和白血病免疫治疗靶抗原的可行性。近期的研究证明在体外培养中PRAME具有免疫原性，能够刺激特异性CD8+的CTL增殖和激活[12]。
总之，PRAME基因作为一种“泛白血病基因”已经引起诸多血液病学者的重视，其不仅广泛表达于多种恶性血液系统疾病，并与疾病的进展和缓解密切相关。以PRAME为标志物用于MRD的检测正得到越来越多学者的认同，其具体作用机制的阐明也为其免疫抑制治疗及基因靶向治疗开辟了新的思路。
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图 1 PRAME基因mRNA表达的电泳图
M：Marker；1：M2；2：M3；3：ALL；4：β-actin；5：阴性对照
Figure 1. Electrophoretic pattern of PRAME mRNA
表 4 PRAME基因表达与染色体核型异常的关系
例 Table 4 Relationship between PRAME gene expression and karyotypic abnormality
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