髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）是儿童常见的恶性中枢神经系统肿瘤之一，近期研究表明其起源于小脑外胚芽层^[1-2]，60%的肿瘤与脑干粘连，多见于后颅凹，生长迅速，手术不易完全切除，且浸润性、转移性较强，以前报道的手术死亡率曾高达17%~ 26.5%，5年生存率约为66%^[3]。近年来，由于综合治疗的发展、神经外科手术与术后放化疗结合，MB的5年生存率已有所提高，但其总体死亡率仍较高。因此，MB的治疗新途径一直是该领域的研究热点。

在肿瘤的形成和细胞增殖过程中，氧化应激反应和炎性反应与其关系密切，而目前已有研究发现多种药物的抗氧化及抗炎作用是通过Nrf-2（nuclear factor erythroid2-related factor2，核因子相关因子2）/ HO-1（heme oxygenase-1，血红素加氧酶-1）信号通路实现^[4-6]。因此，本研究应用免疫组化方法，检测了41例MB及27例瘤旁脑组织中Nrf-2和HO-1的表达情况，并结合研究病例的临床资料（患者性别、年龄、临床症状、肿瘤大小、肿瘤病理分型等），分析二者之间的相关性及其与临床特征的关系，探讨其在MB中的作用，希望能为进一步研究治疗MB的新药物提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

取重庆医科大学第一附属医院病理科2005年9月~2010年9月间明确诊断的MB石蜡标本41例，收集其在神经外科的临床资料（患者性别、年龄、临床症状、肿瘤大小、肿瘤病理分型等）。

兔抗人Nrf-2多克隆抗体浓缩液（稀释度1：200）和兔抗人HO-1多克隆抗体浓缩液（稀释度1：100）来自santa cruz biotechnology公司，SP免疫组化试剂盒和DAB染色试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2   Nrf-2和HO-1蛋白表达的检测

采用常规SP免疫组化染色法，具体操作按说明书染色步骤进行，苏木素复染、中性树胶封片，其中PBS作一抗进行阴性对照。显微镜下观察显色反应。

HO-1阳性着色部位在胞浆，Nrf-2阳性着色部位在胞浆或者胞核。每例在显微镜下随机选择10个高倍镜视野（×400），每个视野计数100个细胞。采用双评分半定量法进行评分，无阳性细胞0分，阳性细胞百分比≤25%记作1分，26%~50%记作2分，51%~75%记作3分，≥76%记作4分；无着色记作0分，淡黄色记作1分，棕黄色记作2分，棕褐色记作3分，两种计分相加：0~1分为（-），2~3分为（+），4~5分为（++），6~7分为（+++），其中（+）~（+++）判为阳性。

1.3   统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析，数据比较采用χ²和Pearson相关性分析，两指标表达相互关系用Spearman秩相关检验。以P <0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Nrf-2在髓母细胞瘤和瘤旁正常脑组织中的表达

Nrf-2主要在MB细胞的胞核中表达，也有部分在胞浆中表达（图 1）。41例MB病例阳性表达率为82.9%（34/41），27例瘤旁正常对照脑组织中阳性表达率为37.0%（10/27），Nrf-2在MB中的表达强于对照脑组织，二者差异有统计学意义（P <0.01，表 1）。

图  1  Nrf-2在髓母细胞瘤中的阳性表达（SP×400）

Figure  1.  The positive staining of Nrf-2 in medulloblastoma(SP×400)

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表  1  Nrf-2在髓母细胞瘤组和正常对照组的表达  例

Table  1.  Nrf-2 expression in medulloblastoma and normal brains

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2.2   HO-1在髓母细胞瘤和瘤旁正常脑组织中的表达

HO-1在肿瘤细胞的胞浆中表达（图 2）。41例切片中阳性表达率为78.0%（32/41），阴性表达率为22.0%（9/41），27例瘤旁正常对照脑组织中阳性表达率为29.6%（8/27），阴性表达率为70.4%（19/27），二者差异有显著统计学意义（P <0.01，表 2）。

图  2  HO-1在髓母细胞瘤中的阳性表达（SP×400）

Figure  2.  The positive cytoplasmic staining of HO-1 in medulloblastoma (SP×400)

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表  2  HO-1在髓母细胞瘤组和正常对照组的表达  例

Table  2.  HO-1 expression in medulloblastoma and normal brains

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2.3   Nrf-2和HO-1蛋白表达的相关性

30例中Nrf-2和HO-1的表达均为阳性，2例仅HO-1表达阳性，4例仅Nrf-2表达阳性，有5例两者的表达均为阴性。经统计学分析Nrf-2和HO-1两者的表达呈正相关性（r_s=0.542，P <0.05，表 3）

表  3  Nrf-2和HO-1表达的相关性  例

Table  3.  The relationship of Nrf-2 with HO-1

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2.4   Nrf-2和HO-1的表达与髓母细胞瘤临床病理特征的关系

41例病例资料如下：男性23例，女性18例，年龄为1~56岁，平均年龄 <15岁，年龄≤15岁的患者所占比例为70.7%（29/41）。手术切除范围全切和次全切的分别为56.1%（23/41）、43.9%（18/41）；肿瘤大小≤1.5 cm³和>1.5 cm³的分别为80.5%（33/41）和19.5%（8/41）；接受放化疗治疗为65.6%（27/41）。

分析结果示，Nrf-2和HO-1蛋白表达与性别、年龄、及肿瘤大小无显著相关（P>0.05，表 4）

表  4  Nrf-2和HO-1的表达与髓母细胞瘤临床病理特征的关系  例

Table  4.  The relationship of Nrf-2 and HO-1 expression with pathophysiological characteristics of medulloblastoma

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2.5   Nrf-2和HO-1的表达与髓母细胞瘤类型之间的关系

Nrf-2和HO-1蛋白表达与MB类型（经典型、促纤维增生型、广泛结节形成型、大细胞间变型）无显著相关性（P=0.230、P=1.000，表 5）。

表  5  Nrf-2和HO-1的表达与髓母细胞瘤病理类型的关系  例

Table  5.  The relationship of Nrf-2 and HO-1 expression with types of medulloblastoma

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3.   讨论

Nrf-2对细胞发挥保护性的抗氧化作用的机制为：在正常生理状态下，Nrf-2主要存在于细胞质中，在受到氧化应激信号刺激时，会迅速移位入细胞核，结合抗氧化剂反应元件（antioxidant response element，ARE），激活ARE下游表达，上调抗氧化基因的表达^[7-8]。Ueda等^[9]发现急性胃黏膜损伤会伴随引起巨噬细胞中Nrf-2易位进入细胞核和HO-1表达上调。这一现象体现了Nrf-2的抗氧化机制，并提示HO-1就是Nrf-2调控的下游细胞因子之一。在对前列腺癌、胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤的研究中人们发现Nrf-2的转录激活和表达水平上调^[10-11]，这一现象提示Nrf-2的抗氧化效应在肿瘤的发展过程中扮演着重要角色。

HO-1是HO（heme oxygenase，血红素加氧酶）中的一种，是催化血红素降解的关键酶，产物为胆绿素、一氧化碳（CO）和游离铁离子。胆绿素随后被还原为胆红素，游离铁离子则结合成铁蛋白。一氧化碳导致血管扩张，抑制血小板聚集。胆红素在正常人血清中能表现出较高的内源性抗氧化活性。铁蛋白中的铁离子也可以减弱细胞的促氧化状态。因此，诱导产生HO-1，可以提供抗氧化应激的细胞保护作用。Jozkowkz等^[13]曾报道在大鼠的心肌缺血再灌注实验中，药物诱导HO-1上调产生的抗氧化抗炎作用对心肌细胞有一定的保护作用。国内外多项针对肺癌、肝癌等恶性肿瘤的研究发现，HO-1在上述肿瘤组织中较正常组织呈明显的高表达状态，这一现象也从侧面证实了HO-1对细胞的抗氧化保护效应，并提示HO-1的高表达与肿瘤的生长密切相关。

由于国内外对Nrf-2和HO-1在MB中的研究情况罕有报道，因此，本研究应用免疫组化SP法检测了Nrf-2和HO-1在41例MB中的表达，并结合研究病例的临床资料，分析了二者之间的相关性及其与临床特征的关系，从而探讨Nrf-2和HO-1在MB中的作用。结果显示MB组织中Nrf-2和HO-1的阳性表达率（82.9%，78.0%）相对于瘤旁正常脑组织的阳性表达率（37.0%，29.6%）明显升高，差异具有显著的统计学意义（P <0.001），并且二者之间显著相关（P < 0.05）。但Nrf-2和HO-1的表达与病例的临床特征无显著相关性（P>0.05）。这一结果与Nrf-2和HO-1在其他许多恶性肿瘤中的表达情况基本一致，将来可能对MB的临床治疗及预后具有一定的帮助和指导作用。但二者之间相互作用的具体机制和高表达状态对肿瘤发展的影响如何，目前尚不明确。

本实验探讨了Nrf-2和HO-1在MB中的表达情况，为治疗MB寻找更有效的治疗靶点提供一定理论依据。