Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）家族中的新成员，又称ML-IAP/KIAP，特异性表达于人的胚胎组织、胎盘组织以及部分恶性肿瘤细胞，具有较强的抗凋亡能力^[1]。多项研究证实Livin可能作为诱导肿瘤细胞凋亡的分子靶点，如利用RNA干扰技术分别在非小细胞肺癌、宫颈癌、肾癌等多种肿瘤中构建Livin特异的基因沉默体系阻断肿瘤细胞Livin基因表达，均增强了肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感性^[2-4]。本课题前期研究也发现Livin在Dukes'B期结直肠癌组织中高表达，并且其表达与肿瘤复发和/或转移、总生存不佳有关^[5]。因此，本研究构建介导RNAi的重组慢病毒载体，在细胞系中稳定抑制Livin基因的表达，并进一步观察Livin基因抑制后大肠癌HT-29细胞生物学特性的改变。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   细胞与试剂

人大肠癌HT-29细胞株购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，逆转录试剂盒Revert Aid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司，羊抗人Livin单克隆抗体购自美国Abcam公司，TUNEL原位检测试剂盒购自南京凯基生物公司，Matrigel基质胶购自BD公司。

1.1.2   RNAi重组慢病毒载体

根据GeneBank获得Livin转录本（NM_13931717.1），设计3个针对Livin基因的siRNA序列和阴性对照（negative control）siRNA，构建的目的慢病毒载体命名为pGCSIL-GFP；框架结构为U6-vshRNA-CMV-GFP（表 1），由上海吉凯基因化学技术有限公司构建及包装，慢病毒浓度为1×10⁸TU/mL。

表  1  目的基因病毒载体构建框架

Table  1.  Designed sequences of siRNA and framework of lentiviral vector

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1.2   方法

1.2.1   病毒感染

常规培养HT-29细胞，实验分5组，分别为空白对照组、阴性对照组及Liv⁃ in-RNAi-LV1、Livin-RNAi-LV2、Livin-RNAi-LV3组。

1.2.2   Real-time PCR检测病毒感染后Livin mRNA的表达

Livin引物序列上游引物为5'-GCTGGGCATATT CTGAGATTGG-3，下游引物为5'-CAGGCACTTGGCACT GTCTTTA-3'；内参序列GAPDH上游引物为5'-TGCAC CACCAACTGCT TAGC-3'，下游引物为5'-GGCATGGA CTGTGGTCATGAG-3'，病毒感染96 h后收集细胞，按Trizol试剂说明书抽提各组总RNA，参照Fermentas公司的逆转录试剂盒说明书合成cDNA。采用SYBR Green Ⅰ法进行Real-time PCR扩增反应，最后行融解曲线分析。测定Ct值表示目的基因mRNA的表达量，2^-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量，分析定量结果。

1.2.3   Western blot检测病毒感染后Livin蛋白的表达

病毒感染后96 h收集细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，用电转法将蛋白转置硝酸纤维素膜上，依次加入封闭液、一抗、二抗进行免疫杂交，再经ECL化学发光试剂盒检测杂交信号，X光片压片曝光，将胶片进行扫描或拍照，用Quantity-one 4.6.2软件进行分析。

1.2.4   台盼蓝拒染法检测细胞增殖活力

病毒感染24 h后1、2、3、4、5、6、7 d收获细胞，每次各组取3孔细胞，台盼蓝染色，计数各孔活细胞数，取平均值，连续计数7 d。根据计数结果，绘制细胞生长曲线。

1.2.5   TUNEL检测细胞凋亡的情况

参考TUNNRL试剂盒进行实验，最后在显微镜下观察显色反应，阳性细胞胞核染成深棕色或棕褐色，随机计数5个高倍视野（×400），计算凋亡指数（AI）=凋亡细胞数（/ 凋亡细胞数+正常细胞数）×100%。

1.2.6   流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡

病毒感染72 h后收集细胞，调整细胞浓度约为1×10⁶/mL，70%乙醇固定，碘化丙酊（PI）室温避光染色30 min。利用流式细胞仪检测细胞内DNA含量，获得各期细胞比例及细胞凋亡率。

1.2.7   Matrigel穿膜侵袭实验检测细胞侵袭能力

100 μL Matrigel铺于Transwell侵袭小室聚碳酯微孔膜（孔径8 μm）的上表面，无血清培养基制备单细胞悬液，细胞密度为5×10⁵个/mL。上室内加入100 μL细胞悬液，下室加入含10%FBS的完全培养基。恒温孵箱中培养48 h后，显微镜下计算穿过膜至背面的细胞数，侵袭率=实验组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数×100%。

1.3   统计学分析

所有数据用统计学软件SPSS 12.0进行分析，计量资料用x±s描述，采用单因素方差分析进行显著性检验，P <0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   重组慢病毒感染HT-29细胞的效率

病毒感染3~4 d后，倒置荧光显微镜下根据携带绿色荧光细胞数占细胞总数的百分比，计算感染效率均>70%（图 1）。

图  1  荧光显微镜下观察Livin-RNAi-LV的感染效率（×100）

Figure  1.  Infection efficiency of Livin-RNAi-LV detected by fluorescence microscope(×100)

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2.2   Real-time PCR和Western blot检测分析

Real-time PCR结果显示Livin-RNAi-LV1组和Livin-RNAi-LV2组Livin mRNA的表达下调，下调分别为0.34±0.10和0.68±0.14，与阴性对照组和空白对照组相比有显著性差异（P <0.01，图 2，表 2）。West⁃ ern blot结果如下（图 3）：与空白对照组和阴性对照组相比，实验组Livin-RNAi-LV1和Livin-RNAi-LV2感染的HT-29细胞的Livin蛋白表达均有下降，差异有统计学意义（P <0.05），而其中Livin-RNAi-LV1的抑制效果较好（P <0.01），这与Real-time PCR的结果基本相符。因此采用Livin-RNAi-LV1进行后续实验。

图  2  各组HT-29细胞Livin蛋白的表达情况

1：空白组；2：阴性对照组：3：Livin-RNAi-LV1；4：Livin-RNAi-LV2；5：Livin-RNAi-LV3

Figure  2.  Expression of Livin protein in each group

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表  2  各组HT-29细胞Livin mRNA的相对表达水平

Table  2.  Relative expression of Livin mRNA in each group

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图  3  不同处理组HT-29细胞的生长曲线

Figure  3.  Cell growth curve of each group

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2.3   细胞生长曲线

实验组从第3天开始细胞生长较对照组明显减慢（P <0.05），到第7天时细胞生长抑制率达到了39.5%，与空白对照组及阴性对照组相比差异均具有统计学意义（P <0.05）。而阴性对照组较空白对照组无显著性差异（P>0.05），说明空载慢病毒对于HT-29细胞的生长无明显影响（图 3）。

2.4   TUNEL检测细胞凋亡的情况

显微镜下可见实验组Livin-RNAi-LV1感染后HT-29细胞中有细胞核被染成棕黄色或棕褐色的凋亡细胞，而对照组偶见凋亡细胞（图 4）。实验组凋亡指数为（26.47±1.80）%，与空白对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义（P <0.01，表 3）。

图  4  正置显微镜下TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡（×400）

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：实验组；箭头所示：凋亡细胞

Figure  4.  Apoptosis index detected by TUNNEL(×400)

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表  3  重组慢病毒感染后HT-29细胞凋亡指数

Table  3.  Apoptosis index in each group

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2.5   流式细胞术（FCM）检测细胞周期及细胞凋亡

实验组细胞出现了明显的凋亡现象，可见典型的“亚二倍体凋亡峰”，凋亡率为38.43%，而空白对照组和阴性对照组细胞均未见明显凋亡现象（图 5）。同时，实验组细胞周期分布发生了明显的改变，G₀/G₁期细胞比例升高，S期细胞比例降低，G₂/M期细胞比例降低，提示Livin基因沉默可使细胞周期重新分布，产生G₀/G₁期阻滞，降低S期和G₂期细胞比例（表 4）。

图  5  流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况

Figure  5.  Cell cycle distribution and apoptosis rate detected by flow cytometry

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表  4  流式细胞术检测重组慢病毒感染对细胞周期的影响  %（x±s）

Table  4.  Cell cycle in each group by flow cytometry

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2.6   Matrigel穿膜侵袭分析

显微镜下可见实验组Livin-RNAi-LV1感染后HT-29细胞穿膜细胞数为102.33±13.01，少于空白对照组（532.67±32.93，P <0.01）和阴性对照组（511.00± 21.07，P <0.01）（表 5）。

表  5  各组细胞体外侵袭能力

Table  5.  Difference in cell invasive ability among groups

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3.   讨论

慢病毒载体（lentivirus vectors，LV）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础，截去其复制相关基因序列，代之以治疗基因或基因治疗载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，能够将肿瘤治疗基因安全高效地整合到人体内，使治疗基因长期、稳定、高效地表达，而不易诱发宿主免疫反应，利用慢病毒载体作为介导RNAi的工具，可以将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNAi特异性沉默同源基因表达的作用结合起来，较脂质体载体抑制效应更稳定，较质粒表达载体抑制作用更高效，是目前进行转基因和RNAi研究最好的工具之一。

本研究设计合成3对靶向Livin基因的siRNA，构建siRNA表达的重组慢病毒载体，利用病毒感染HT-29细胞，在细胞内转录生成shRNA，Dicer酶作用下产生siRNA，实现基因沉默的目的。通过Real-time PCR和Western blot检测结果发现Livin-RNAi-LV1和Liv⁃ in-RNAi-LV2感染HT-29细胞后Livin mRNA和蛋白的表达水平明显下降，其中Livin-RNAi-LV1的抑制效果较好达64.62%，而Livin-RNAi-LV3无沉默现象，出现这种差别的原因可能与siRNA设计的不同空间构象与靶基因的结合有关。因此，筛选Livin-RNAi-LV1为具有最佳干扰效率的重组慢病毒进行后续研究。

HT-29细胞Livin基因抑制后，随着培养时间的延长，细胞生长较对照组明显减慢（P <0.05），细胞生长曲线低平，细胞克隆形成率仅17.33%，克隆形成能力明显减弱，也反映了细胞增殖活力的下降。同时，TUNEL法和FCM检测均发现大肠癌HT-29细胞明显发生凋亡。其机制可能与Livin基因能够抑制肿瘤细胞增殖，当其表达抑制后，肿瘤细胞凋亡抑制因素减弱，诱导HT-29细胞自发凋亡，从而影响肿瘤的生长。

研究发现细胞周期调控异常与细胞恶变密切相关^[6]，细胞周期调节紊乱是恶性肿瘤细胞凋亡和增殖异常的重要原因，细胞周期的调控实际上就是对细胞周期调控点G₀/G₁、S和G₂/M的调控，是以细胞周期蛋白的合成和降解为主的多因素参与过程^[7]。本研究发现Livin-RNAi-LV1感染后的HT-29细胞周期的分布发生了明显的改变，G₀/G₁期细胞比例升高（P < 0.05），S期细胞比例降低（P <0.05），G₂/M期细胞比例降低（P <0.05），这提示Livin基因沉默可使细胞周期重新分布，产生G₀/G₁期阻滞，从而降低S期和G₂期细胞比例。同时，Livin抑制后的HT-29细胞增殖周期进展受阻，从而促进了细胞凋亡的进程。因此，认为Livin的表达可能具有细胞周期依赖性。本研究与王琳琳等^[8]在黑色素瘤A375细胞中的研究相似，均认为Livin基因沉默后出现了G₀/G₁期阻滞。

侵袭性是恶性肿瘤浸润性生长和转移的条件，国内外关于Livin与肿瘤侵袭性的研究鲜见报道。Liu等^[9]利用siRNA真核表达载体转染肝癌细胞株SMMC-7721，发现沉默Livin后明显减弱了SMMC-7721细胞的侵袭能力。本研究利用慢病毒载体介导RNAi沉默Livin基因后，发现实验组穿膜细胞数明显减少，提示大肠癌HT-29细胞的侵袭能力明显下降。Livin与大肠癌的侵袭性的相关机制尚需进一步研究。研究者发现Survivin与大肠癌侵袭性相关，Survivin被沉默后，使大肠癌SW480细胞阻滞在G₂/M，影响微管、微丝的装配，可能引起细胞黏弹性系数下降，进而引起细胞侵袭能力下降，另外抑制Survivin表达可降低肿瘤血管生成因子VEGF的表达，进而抑制大肠癌SW480细胞的侵袭性^[10]。Livin与Survivin有相似之处，是否也能通过此机制来抑制细胞的侵袭性有待深入研究。

总之，本研究发现慢病毒载体介导的RNAi技术能够高效而稳定地抑制大肠癌HT-29细胞中Livin基因的表达，且沉默Livin基因后的HT-29细胞增殖能力受到抑制，细胞凋亡增加，细胞周期重新分布，细胞侵袭性减弱，为大肠癌靶向Livin的基因治疗提供理论基础。