Association of p73 Polymorphisms with Genetic Susceptibilities to Breast Cancer: A Case-control Study
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摘要:目的 探讨p73基因G4C14-A4T14多态性与中国重庆地区汉族女性乳腺癌遗传易感性的关系。方法 采用病例对照研究, 利用Sequenom Mass Array®iPLEX GOLD系统对170例乳腺癌患者和178例健康者对照的p73基因G4C14-A4T14单核苷酸多态性进行了检测, 并对检测结果进行t检验、χ2检验和非条件Logistic回归分析。结果 p73基因G4C14-A4T14多态基因型和等位基因型在乳腺癌组和对照组的分布频率差异无统计学意义(χ2=2.750, P=0.253;χ2=2.195, P=0.138);与携带GC/AT和AT/AT基因型的个体比较, 携带GC/GC基因型的个体患三阴性乳腺癌发病风险显著增加(OR=2.992, 95%CI: 1.300~6.890, P=0.010)。结论 p73基因G4C14-A4T14多态性与中国重庆地区汉族女性三阴性乳腺癌的发病风险相关, GC/GC基因型是中国重庆地区汉族女性三阴性乳腺癌的易感基因型; 携带GC/GC基因型的乳腺癌可能预后不良。Abstract:Objective This study aims to evaluate the association between p73 G4C14-A4T14 polymorphisms and susceptibility to breast cancer in Chongqing women of Han Nationality in China.Methods In a case-control study of 170 breast cancer patients and 178 healthy controls, single nucleotide polymorphisms(SNPs)of p73 G4C14-A4T14 at exon 2 were genotyped by the Sequenom Mass Array® iPLEX GOLD System.Data were analyzed via t-test, Chi-square test, and logistic regression analysis.Results The distribution of p73 genotypes and allelotypes had no significant difference between the breast cancer patients and healthy controls(χ2=2.750, P=0.253;χ2=2.195, P=0.138).Individuals carrying the GC/GC genotype have a higher risk of developing triple negative breast cancer(TNBC)than individuals carrying the GC/AT and AT/AT genotypes(OR=2.992, 95%CI=1.300~6.890, P=0.010).Conclusion p73 G4C14-A4T14 polymorphisms are closely associated with the increased risk for TNBC in Chongqing women of Han Nationality in China.The GC/GC genotype is susceptible to TNBC in Chongqing women of Han Nationality in China.Breast cancer patients carrying the GC/GC genotype may have bad prognosis.
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Keywords:
- Breast cancer /
- Triple negative /
- p73 gene /
- Polymorphism /
- Tumor susceptibility
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p73基因是p53的家族成员之一, 其基因位于人类染色体1p36.33;其编码的蛋白质在结构、功能上与p53相似, 具有通过转录激活p21WAF1/CIP1等p53靶基因, 抑制正常和转化细胞的生长, 促进凋亡的功能[1]。因此p73基因被认为是一个极有希望的候选抑癌基因, 可能与肿瘤的发生、发展相关。p73基因第2外显子的第4和第14位上, 存在两个自然关联的由鸟嘌呤与腺嘌呤(G-A)以及胞嘧啶与胸腺嘧啶(C-T)双核苷酸相互置换的多态性(G4C14-A4T14), 在启始密码子AUG的上游形成一个茎环结构, 影响p73基因表达[1]。推测p73基因G4C14-A4T14多态性可能与乳腺癌发病风险有关, 本研究基于人群的病例对照研究, 利用MassARRAY-IPLEX技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)平台检测p73基因G4C14-A4T14多态性, 探讨其多态性与中国重庆地区汉族女性乳腺癌遗传易感性的关系。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象
所用研究对象均为中国重庆地区汉族女性, 包括乳腺癌患者170例和健康对照者178例。乳腺癌组来源于重庆市肿瘤研究所乳腺中心和重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科为2010年1月至2010年12月收治的乳腺癌患者, 所有患者均为新发肿瘤, 均经病理证实, 入组前均未接受任何抗癌治疗。健康对照者来源于同期重庆市肿瘤研究所肿瘤筛查中心进行健康体检的无肿瘤及其他遗传疾病的无关个体。将母系家族中一级直系亲属患有乳腺癌者定义为有乳腺癌家族史。
1.1.2 主要试剂和仪器
DNA提取试剂盒(美国Omega公司); 自动点样仪(Nanodispenser RS1000 v 1.2.1, 美国Sequenom公司); SpectroCHIP芯片(美国Sequenom公司); MALDI-TOF-MS(美国Sequenom公司)。
1.2 方法
1.2.1 标本采集和DNA提取
在获得知情同意后, 抽取乳腺癌患者及健康志愿者清晨空腹外周静脉血2 mL, 并置于酸性枸橼酸葡萄糖抗凝管中, -40℃保存; 应用DNA提取试剂盒提取DNA (按说明书操作), DNA保存于-70℃备用。
1.2.2 引物设计与合成
根据基因的目标序列和所选择的多态性位点, 利用Sequenom MassARRAY®Assay Design 3.1软件(美国Sequenom公司)设计多重PCR特异性扩增引物和单碱基延伸引物, 上海英骏生物公司(invitrogen)负责引物合成。引物序列见表 1。
表 1 p73基因G4C14-A4T14多态位点引物序列Table 1. Primer sequences of G4C14-A4T14 polymorphisms in p73
1.2.3 基因分型分析
提取纯化后的基因组DNA样品定量稀释至100 ng/μL, 按设计顺序加1μL/孔样品于384孔板上, 然后添加PCR扩增体系使反应物的终浓度为0.1 U的Taq聚合酶, 100 ng基因组DNA, 各2.5 pmoL的PCR引物, 25 mmoL的dNTP。PCR反应条件为: 95℃ 15 min, 然后95℃20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s循环45次, 72℃ 5 min。添加0.3 U的虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)去除剩余的dNTP。单碱基延伸反应通过添加5.4 pmoL的各延伸引物, 50μmoL的dNTP/ddNTP混合物, 0.5 U的Thermosequenase DNA聚合酶, 反应条件为94℃ 2 min, 然后40个循环的94℃ 5 s, 52℃ s, 80℃ 5 s。反应产物用树脂脱盐20 min后经自动点样仪点样于SpectroCHIP (sequenom)芯片。点样后的芯片用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(SpectroREADER, Sequenom)检测。
1.3 统计学分析
应用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学处理。t检验比较两组间年龄差异, χ2检验比较两组间绝经状况和乳腺癌家族史的差异; 分别计算各组p73基因多态基因型频率, 并由基因型计算等位基因频率。χ2检验确定其是否符合Hardy-Weinberg平衡, χ2检验比较基因型的组间分布频率; 应用非条件Logistic回归分析计算比值比(OR)和95%可信区间(CI)以分析和比较不同基因型与乳腺癌风险之间的相关性, 并排除年龄、绝经状况及乳腺癌家族史等混杂因素的影响。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料比较
乳腺癌组年龄31~80岁, 平均年龄50.1岁; 绝经前99例, 绝经后71例; 有乳腺癌家族史的4例。对照组年龄26~84岁, 平均年龄48.4岁; 绝经前91例, 绝经后87例; 有乳腺癌家族史的3例。两组之间年龄、绝经状况及乳腺癌家族史差异无统计学意义(P > 0.05, 表 2)。
表 2 乳腺癌患者及健康对照者临床资料比较 例(%)Table 2. Distributions of selected variables in breast cancer cases and control subjects
2.2 p73基因型、等位基因型分布及其与乳腺癌发病风险的关系
p73基因在乳腺癌组和对照组中有AT/AT、GC/AT和GC/GC三种基因型, 两组中p73基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.492, P=0.782;χ2=0.001, P=1.000)。乳腺癌组AT/AT、GC/AT和GC/GC基因型频率分别为2.9%、34.7%和62.4%, 对照组3种基因型频率分别为6.2%、37.6%和56.2%, 两组间基因型分布频率差异无统计学意义(χ2=2.750, P=0.253, 表 3)。与AT/AT基因型相比, 携带GC/AT、GC/GC基因型不改变乳腺癌的发病风险(OR=1.937, 95%CI=0.636~5.897, P=0.129;OR=2.331, 95%CI=0.782~6.947, P=0.245, 表 3)。乳腺癌组AT、GC等位基因频率分别为20.3%和79.7%, 对照组AT、GC等位基因频率分别为25.0%和75.0%, 两组间等位基因型分布频率差异无统计学意义(χ2=2.195, P=0.138, 表 3); 与AT等位基因相比, 携带GC等位基因不影响乳腺癌的发病风险(OR=1.309, 95%CI=0.916~1.871, P=0.139, 表 3)。
表 3 p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌易感性的关系 例(%)Table 3. Distributions of the p73 G4C14-to-A4T14 polymorphism and risk of breast cancer
2.3 分层分析
按照绝经状况进行分层分析, 与携带GC/AT和AT/AT基因型的个体相比, 携带GC/GC基因型的个体的乳腺癌发病风险无明显增加(P > 0.05, 表 4)。
表 4 p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌发病风险的分层分析 例(%)Table 4. Stratification analysis of p73 genotypes by menstrual status
2.4 p73基因多态性与乳腺癌病理类型、三阴性乳腺癌的关系
p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌病理类型无明显相关性(P > 0.05);与携带GC/AT和AT/AT基因型的个体相比, 携带GC/GC基因型的个体的三阴性乳腺癌发病风险明显增加(OR=2.992, 95%CI=1.300~6.890, P=0.010, 表 5)。
表 5 p73基因G4C14-A4T14多态性与三阴性乳腺癌的关系Table 5. Correlation between p73 polymorphism and triple negative breast cancer
3. 讨论
p73基因由于特殊的染色体定位, 并且其所编码的蛋白质在结构上、功能上都与P53蛋白极其相似, 因而被认为是一个极有希望的候选抑癌基因。但下列研究显示p73基因不是经典的肿瘤抑制基因, p73-/-的小鼠并无肿瘤易患现象的发生[2]; 尽管先前的报道显示p73有肿瘤相关性缺失, 但后来的研究未发现p73基因的突变, 相反却发现p73基因在某些肿瘤有表达上调[3]。
p73基因G4C14-A4T14多态性与肿瘤易感性关系的研究较多[4-9], 最近的研究显示[10]p73基因G4C14-A4T14多态性与肿瘤易感性相关, 但存在种族和肿瘤类型的差别, 对26项独立研究(包含8 148例肿瘤患者和8 150例健康对照者)进行Meta分析, 发现p73基因C4C14-A4T14多态AT等位基因携带者患宫颈癌、结直肠癌及头颈部肿瘤等多种肿瘤的危险性显著增加; 分层分析发现p73基因G4C14-A4T14多态与白种人的肿瘤易感性相关。Yu等[1]对23项研究(包含6 635例肿瘤患者和7 378例健康对照者)进行Meta分析, 发现p73基因G-4C14-A4T14多态与亚洲人种和白种人的结直肠癌发病风险密切相关; Liu等[12]对27项独立研究(包含8 017例肿瘤患者和11 610例健康对照者)进行Meta分析, 发现p73基因G4C14-A4T14多态AT/AT基因型携带者多种肿瘤的发病风险显著增加; 按种族进行分层分析发现AT/AT基因型显著增加白种人和亚洲人种的肿瘤的发病风险, 特别是美国人和日本人; 按肿瘤类型进行分层分析发现AT/AT基因型显著增加结直肠癌、头颈部肿瘤和其他肿瘤的发病风险。
p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌易感性关系的研究较少, 未检索到p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌遗传易感性的相关报道。Huang等[13]对200例乳腺癌和282例健康对照者的p53基因Arg72Prop和p73基因G4C14-A4T14单核苷酸多态性进行检测, 发现两组之间p73基因G4C14-A4T14多态基因型分布频率差异无统计学意义, 本研究认为p73基因G4C14-A4T14单核苷酸多态性与日本人群的乳腺癌风险无明显关系。本组资料显示p73基因G4C14-A4T14多态在乳腺癌组和对照组中基因型分布频率差异无统计学意义; 但与三阴性乳腺癌的发病风险相关; 与携带GC/AT和AT/AT基因型的个体相比, 携带GC/GC基因型的个体的三阴性乳腺癌发病风险明显增加。
综上所述, 本研究初步结果显示p73基因G4C14-A4T14多态性与中国重庆地区汉族女性三阴性乳腺癌的发病风险相关, GC/GC基因型是中国重庆地区汉族女性三阴性乳腺癌的易感基因型。研究已经证实三阴性乳腺癌复发转移率较高, 预后较差, 目前尚无针对性的治疗方案[15], 因此携带GC/GC基因型的乳腺癌患者可能预后不良, 此结论尚须以扩大样本量进行随访以进一步验证。
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表 2 乳腺癌患者及健康对照者临床资料比较 例(%)
Table 2 Distributions of selected variables in breast cancer cases and control subjects
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表 3 p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌易感性的关系 例(%)
Table 3 Distributions of the p73 G4C14-to-A4T14 polymorphism and risk of breast cancer
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表 4 p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌发病风险的分层分析 例(%)
Table 4 Stratification analysis of p73 genotypes by menstrual status
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表 5 p73基因G4C14-A4T14多态性与三阴性乳腺癌的关系
Table 5 Correlation between p73 polymorphism and triple negative breast cancer
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