近年来，肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势，导致肺癌患者治疗失败的主要原因之 一是肺癌细胞的转移。因此，探明肺癌转移的调控基因及其分子机制至关重要。microRNA（miRNA）是一类长约22 nt的非编码单链RNA，通过与目标miRNA互补配对导致 miRNA 降解或 抑制转录后翻译诱导基因沉默。大量研究表明，异常表达的miRNA与人类多种肿瘤的转移密切相关^[1]，但其确切机制尚未完全明确，研究miRNA的关键是准确预测miRNA的靶 基因和正确认识其生物学功能。

miR-29b含有2个成员，miR-29b1和miR-29b2，分别位于人染色体 7q32.3 和 1q32.2 反义 链，因其碱基序列完全一致，故统称为 miR-29b。本研究利用miRNA PCR 芯片，筛选出 miR- 29b 在 CD133 阳性A549 细胞中表达明显下调，通过生物信息学预测miR-29b的靶基因，并对 其靶基因进行功能富集分析和信号转导通路富集分析，以期为以miR-29b为靶点的肿瘤研究提供线索。

1.   材料与方法

1.1   材料

A549细胞株由广州医科大学中心实验室提供。磁珠分离试剂盒、磁性分选系统为德国 Miltenyi公司产品。利用miRNA靶基因数据库miRecords（http：//mirecords.biolead.org）进行miR-29b靶基因的预测和查找已有实验数据支持的靶基因，此数据库集成PicTar、miRanda、DIANA-microTest、TargetScanS、Microinspector、miRDB、miTarget、NbmiRTar、PITA、RNA22和RNAhybrid共11个公用的miRNA靶标预测工具；采用GOEAST^[2]（ http：// omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/）中Gene Ontology数据库对靶基因进行功能富集分析；使 用DAVID数据库（http：//david.abcc.ncifcrf.gov）对靶基因进行KEGG信号转导通路富集分析。

1.2   方法

1.2.1   CD133阳性/阴性肺癌细胞的分离

将对数生长期的A549细胞制成单细胞悬液，取约10⁷个细胞加入300 μL缓冲液 重悬，再依次加入100 μL FCR阻断剂及100 μL CD133磁性微珠，充分混悬后4℃暗处孵育30 min，续加缓冲液洗脱、重悬。将细胞悬液移入已经安装在磁性分选架的阳性分选柱中，待细胞悬液流出，加入2倍体积的缓冲液洗脱分选柱（洗脱下来的含 CD133 阴性细胞）。待洗 脱缓冲液流出后加入500 μL缓冲液，装上分选柱配套的柱芯，快速推柱芯，收集流出液为 CD133 阳性细胞。取阴性分选柱安装在磁性分选架上，将阳性分选过程收集的流出液加入分 选柱中，续用缓冲液洗脱，收集流出液为CD133阴性细胞。

1.2.2   CD133 阳性/阴性肺癌细胞差异 miRNAs 表达的检测

miRNA 抽提及质量检测、cDNA 合成与RT-PCR、图像与数据分析等由上海康成生物有限公 司完成。

1.2.3   RT-qPCR 验证芯片中部分差异 miRNAs 表达

特异的RT引物和TaqMan探针购自美国ABI公司，用于定量检测hsa-miR-337-3p（TM：002157 ，PN：4427957），hsa-miR-29b（TM：000413，PN：4427957），hsa-miR-26a（TM：000405，PN：4427957），U6（TM：001093，PN：4427957）为内参。收集分选后的CD133阳性细胞及 CD 133 阴性细胞，按 TRIZOL（Invitrogen公司）说明书提取 RNA，cDNA 合成和 PCR 按照 Taq⁃ Man® MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI）和TaqMan® MicroRNA Assays（ABI）说明 书进行。反应条件：50℃ 2 min，95℃预变性 2 min，循环参数为95℃ 15 s，60℃ 60 s， 共循环40次。每个样品设3个复孔，按上述条件置RT-qPCR仪上进行扩增反应，实验重复3次。采用ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.4   miR-29b生物信息学分析

采用数据库miRecords对miR-29b进行靶基因预测，为了降低假阳性，选择至少 6 种 miRNA 靶标预测工具预测的交集。GOEAST^[2]可以实现基因的GO，根据GO注释中的生物 学过程和分子功能进行Gene Ontology注释层次分类及富集分析。用DAVID数据库对预测的靶 基因集合进行基于KEGG的生物通路富集分析，通过FisherExect Test计算 P 值，以 P＜0.05 为显著性阈值得到基因集合相对于背景具有统计意义的信号转导及疾病 通路。

1.3   统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，两组均数比较采用独立样本的t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   miRNA表达谱分析结果

与 CD133 阴性细胞相比，CD133 阳性 A549 细胞在376个检测的miRNAs中表达差异达2倍 或以上的有51个，占38.3%（51/133）。其中14个miRNAs表达均 增 高 ，37 个 miRNAs 表 达 均 降 低 ，miR-29b 在CD133阳性A549细胞中表达下调了7.24倍（图 1）。

图  1  CD133阳性和阴性肺腺癌细胞部分差异表达的miRNAs

Figure  1.  Partially differential expression of miRNAs in CD133 + and CD133- A549 cells

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2.2   miRNA PCR芯片中部分差异表达基因的验证

选取 miR-29b、miR-337-3p、miR-26a 等 3 个差异显著的 miRNAs，应用 RT-qPCR 检测了 其表达（图 2）。与CD133阴性细胞比较，CD133阳性A549细胞的miR-29b、miR-337-3p、miR-26a等3个miRNAs表达均下调。该结果与 miRNA PCR 芯片的检测结果一致。

图  2  RT-qPCR验证部分差异表达miRNAs在CD133阳性与CD133阴性A549细胞中的表达

Figure  2.  Partially differential expression of miRNAs in CD133+ and CD133- A549 cells detected by RT-qPCR

A: Amplication curve; B: Related expression of miR-26a, miR-29b and miR-337-3p

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2.3   miR-29b生物信息学分析

2.3.1   miR-29b靶基因预测

用数据库miRecords对miR-29b的靶基因进行预测，发现至少6种算法预测的交集靶基因有 94个。miRecords数据库还提供已有实验数据支持的 miRNAs 的确切靶基因，经检索获得miR- 29b的实验验证靶标18个，包括BACE1、CAV2、CDK6、CDC42、COL1A1、COL2A1、COL3A1、DNMT3A、DNMT3B、DNAJB11、INSIG1、MCL1、MMP2、PIK3R1、SP1、SFPQ、TET1、TCL1，其中CAV2、COL2A1、DNMT3A、DNMT3B、INSIG1、TET1也包含在预测的靶基因中。集合数据库预测靶基因的交集与实验验证靶基因，本研究将这106个基因行进一步分析。

2.3.2   靶基因的功能富集分析

对miR-29b的106个靶基因进行功能分析，具体分析结果见表 1。发现有101个基因在GO中 注释，这些基因分布于68个群中，其中在GO分子功能富集分析中，miR-29b的靶基因多起结 合作用，共有 86 个。在生物学过程中，miR-29b的靶基因主要参与了细胞过程和生物调控 过程。

表  1  miR-29b靶基因的GO基因功能分析

Table  1.  GO gene function analysis of miR-29b targets

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2.3.3   靶基因的信号转导通路富集分析

结果显示miR-29b 的靶基因富集于 15 个通路中，分别是参与细胞通讯的黏着斑，信号传 导的细胞外基质与受体相互作用，癌症相关的通路，细胞免疫有关的白细胞跨内皮迁移，细菌感染的致病性大肠杆菌感染，物质代谢的萜类化合物骨架代谢通路，VEGF信号传导通路，JAK-STAT信号传导通路，TGF-β信号传导通路，MAPK信号传导通路及与癌症相关的胶质瘤通路、前列腺癌通路、黑色素瘤通路、小细胞肺癌通路和非小细胞肺癌通路（表 2）。

表  2  miR-29b靶基因的Pathway富集分析结果

Table  2.  Pathway enrichment analysis of miR-29b targets

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3.   讨论

CD133 是目前使用较广泛的肿瘤干细胞标记物。研究发现，与CD133阴性细胞相比，CD133 阳性细胞在体内外实验表现出更高的增殖潜能、转移能力和放化疗抵抗性^[3-4] 。因此，本研究以CD133为切入点，利用miRNA PCR芯片检测CD133阳性和阴性肺癌细胞的 miRNA 表达谱，筛选出差异 miRNAs，以期寻找出肺癌转移相关miRNAs。结果显示，在差异表 达的 miRNAs 中 miR-29b 在 CD133 阳性肺癌细胞中低表达。亦有文献报道miR-29b在肺癌 组织和肺癌细胞系中表达下调^[5-6]，提示 miR-29b 可能发挥抑癌基因的作用。 已有研究验证miR-29b在肝癌中直接负调控降解细胞外基质和基底膜的MMP2^[7]，在肺癌细胞中miR-29b可直接抑制甲基转移酶DNMT3A/DNMT3B，从而诱导因 DNA 甲基化而沉 默的抑癌基因表达^[5]。这些基因在肿瘤细胞的侵袭转移过程中都发挥着重要作 用，因此，本研究认为miR-29b可能是一个肺癌转移相关miRNA。

miRNA 的功能主要是通过其靶基因来体现，靶基因的发现是先通过生物信息学方法预测， 然后实验证明。尽管现在有很多在线软件如 Targetscan、Pictar、miRanda 等软件能对 miRNA 的靶基因进行预测，但不同的软件因算法不同有不同的优势和缺陷，所以预测的结果 均不相同。本研究采用数据库miRecords 预测靶基因，取其至少 6 种预测工具的交集作为预 测到的靶基因，获得94个靶基因，尽管预测的靶基因数目相对减少，但增加了预测的精确度。交集已经实验验证的18个确切的靶基因，共得到106个靶基因用于GO分类和Pathway分析。

GO分类分析发现miR-29b靶基因的功能多为结合、细胞外基质形成等，该结果在许多实 验中得以验证，miR-29b可直接抑制多种胶原蛋白表达^[8-10]。胶原蛋白是细胞 外基质最主要的成分，在细胞外基质异常聚集所致纤维化中发挥着举足轻重的作用。miR-29b参与了多种器官如肝、肺、心和肾的纤维化。肝星状细胞是肝脏中分泌细胞外基质蛋白最主 要的细胞，Roderburg 等^[8]发现 miR-29b 在肝脏星状细胞中表达最高，当肝纤 维化时，miR-29b表达异常下调。相似的是，van Rooij等^[10]发现miR-29b在心脏 接近梗死区域表达明显下降，胶原蛋白 COL1A1、COL1A2、COL3A1 和 FBN1 为 miR-29b 靶基 因，而且miR-29b与这些蛋白在心肌梗塞组织中的表达呈反向关系，说明miR-29b参与了心肌纤维化调节。

在KEGG信号传导通路分析中，本研究发现miR-29b靶基因富集于VEGF、TGF-β、MAPK、JAK-STAT等多个信号传导通路，而且与胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌等多种肿瘤密切相关。研究表明，异常表达的miR-29b与多种肿瘤的发生发展密切相关。Cortez等^[11]在胶质瘤细胞中过表达miR-29b可直接抑制PDPN蛋白表达，从而抑制癌细胞的增殖、迁 移，诱导其凋亡。此外，miR-29b可通过直接抑制抗凋亡蛋白Mcl-1表达从而诱导前列腺癌细胞凋亡^[12]，通过直接抑制细胞周期相关蛋白CDK6表达从而抑制黑色素瘤细胞增 殖^[13]。这些研究与KEGG分析结果是一致的。miR-29b通过抑制靶蛋白的表达参与 多条信号通路的调控，包括JAK-STAT和TGF-β通路等。JAK-STAT信号通路是一条由细胞因子包 括IFN刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。Schmitt等^[13]发现在黑色素瘤细胞中IFN-γ可通过激活JAK-STAT通路上 调miR-29b的表达，而上调的miR-29b可直接靶向IFN-γ抑制其蛋白表达，从而构成一个自调控 反馈环。TGF-β通路是最重要的致纤维化的通路。在小梁网细胞中，TGF-β2能抑制miR-29的表 达，过表达miR-29b可抑制TGF-β1和TGF-β2引起的细胞外基质升高^[14]。 Sterlacci等^[15]在383例非小细胞肺癌组织中发现TGF-β通路的异常活化与患者的 预后呈负相关。TGF-β通路在肺癌中过度活化可能与miR-29b下调有关。TGF-β/Smad通路在肿瘤转移早期事件EMT中也有重要作用，因此，如能在这些生物信息学分析得到的结果的基础上，通过实验证实miR-29b在肺癌中调控这些信号通路的具体机制，对基于miRNA为靶点的肿瘤防治有重要意义。