在特定细胞因子环境中，初始CD4⁺T细胞在接受抗原刺激后，会朝着不同的辅助T细胞（helper T cell，Th）方向分化，如Th1、Th2、Th17细胞，还有近期发现的Th9、Th22细胞等。大量的研究表明，Th9细胞参与抗肿瘤免疫应答相关过程，主要通过分泌相关细胞因子影响肿瘤的生长、转移^[1-3]，本文旨在对Th9细胞的抗肿瘤免疫作用及相关机制、相关信号通路等方面进行阐述，为抗肿瘤治疗提供新的视野和思路。

1.   Th9细胞

1.1   Th9细胞来源

1994年，Schmitt等^[4]研究发现转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白细胞介素-4（interleukin，IL-4）、白细胞介素-2（interleukin，IL-2）在一定条件下可诱导幼鼠初始CD4⁺T细胞大量分泌IL-9。随后在2008年，两项研究先后报道^[5-6]，TGF-β联合IL-4诱导小鼠初始CD4⁺T细胞分化为一类可分泌IL-9或IL-9、IL-10的新辅助T细胞，这种不同于Th2或Treg、Th17、Th1的新细胞，被命名为Th9细胞。2010年，Wong等^[7]研究发现人体中也存在类似情况，并把这种不同于Th2的细胞也称为Th9细胞。

初始CD4⁺T细胞在特定细胞因子环境下，向着不同Th细胞分化，若细胞因子是IL-12或IFN-γ可分化为Th1，IL-4则分化为Th2，TGF-β对应是Treg细胞，而Th17则需要TGF-β和IL-6刺激^{[3, 8]}，Th22细胞则需要TNF-α和IL-6刺激^[9-10]。

1.2   Th9细胞可塑性

除了上述情况，其他细胞在特定的条件下亦能分化为Th9细胞，如Th2、Treg、记忆T细胞等。相反，Th9细胞也可以获得其他辅助细胞的表型，分泌其相关因子，具有一定的可塑性。研究发现无法分泌IL-9的Th2细胞系中加入TGF-β后，IL-9的表达明显上升，Veldhoen等^[5]研究认为这是Th2细胞被TGF-β诱导向Th9细胞转化。Tan等^[11]研究发现Th9细胞在特定细胞因子环境下可获得Th1、Th2、Th17相关表型，并大量分泌IFN-γ、IL-4、IL-17，但IL-9却无法检出。Putheti等^[12]研究表明，人体内TGF-β和IL-4不仅可以诱导初始CD4⁺CD45RA⁺T细胞，也可诱导记忆CD4⁺CD45RO⁺细胞分泌IL-9。有研究表明，调节T细胞（regulatory T cells，Tregs）也可向Th9细胞分化^[12]。Liu等^[13]研究发现Th2可以促进Treg细胞转化为Th9细胞，能被IL-4或TGF-β的抗体所抑制。2015年，有两个研究团队先后发现Treg可被诱导转化为Th9细胞，具体过程是TGF-β联合IL-2诱导初始CD4⁺T细胞激活后可产生Foxp3⁺Treg细胞，该细胞上糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein，GITR）高表达，放入相关激动剂DAT-1后发现Tregs细胞数量明显减少，而Th9细胞明显增多，30%~40% Tregs转化为Th9，而且并没有向其他细胞分化^[14-15]。其他研究发现，钠氢交换蛋白1（Na⁺/H⁺exchanger，NHE1）可能影响Th9与Treg两者平衡，敲除NHE1后检测到的Th9细胞比例减少，而Treg细胞增多，提示Th9可能转化为Treg细胞，但并未给出直接证据（图 1）^[16]。

图  1  初始CD4⁺T细胞分化及Th9细胞来源与可塑性^[16]

Figure  1.  Differentiation of primary CD4⁺T cells and the origin & plasticity of Th9 cells^[16]

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2.   人体Th9细胞

肿瘤患者外周血，或胸、腹腔积液，以及癌组织中的Th9细胞都明显升高，而且人体Th9细胞可能参与肿瘤进展过程，但具体作用尚待明确。更重要的是Th9分布可能与肿瘤的分期有一定的关系。有研究发现，喉鳞状细胞癌和小细胞肺癌患者外周血中Th9比对照组明显升高，并且Ⅲ、Ⅳ期喉癌患者较Ⅰ、Ⅱ期Th9细胞升高显著^[17-18]。Yang等^[19]研究发现晚期肝癌腹腔积液中Th9细胞明显较早期升高，其结论与上述研究结果一致。一项关于大肠癌的研究却提出截然相反的观点，认为Th9与大肠癌Ducks分期呈负相关，而且相比外周血、癌旁组织中，结肠癌组织中Th9明显升高^[20]。除此之外，肺癌患者胸腔积液中Th9细胞相对于正常志愿者的外周血中明显升高，且高Th9患者的生存期显著缩短，表明Th9与肿瘤的预后密切相关^[21-22]。

记忆性Th9细胞也可能与肿瘤发生、发展有联系。Bu等^[23]研究发现肺癌患者的恶性胸腔积液中Th9细胞表面CD45RO表达上升，上述大肠癌的研究同样也发现癌组织Th9细胞表面CD45RO蛋白高表达^[20]。

3.   Th9细胞抗肿瘤免疫作用

3.1   Th9细胞抑制肿瘤生长与转移

Purwar等^[1]研究发现Th9细胞能够抑制黑色素瘤的增长，该研究将Th9细胞和对照组分别输入免疫功能不全的黑色素瘤小鼠，前者黑色素瘤细胞生存期明显优于后者，而且相对于Th1、Th2、Th17细胞抑制肿瘤作用更强。Lu等^[2]研究发现Th9细胞可明显减少黑色素瘤小鼠肺转移瘤灶数量，并且较Th1效果强。后来研究大多按照上述的黑色素瘤小鼠动物模型进行相关试验，相继发现Th9细胞能够抑制肿瘤生长^{[15, 24]}。除了黑色素瘤外，Th9细胞还可以抑制鳞状细胞癌的生长^[25]。近期一项有关Th9相关疫苗的研究表明，Th9细胞通过分泌IL-9阻碍肿瘤细胞种植及扩散^[26]。综上所述，Th9细胞可以抑制肿瘤的生长和转移，并强于其他辅助T细胞。

3.2   Th9细胞促进肿瘤生长

Th9细胞促进肿瘤的生长作用并无直接的动物实验证据，该作用主要通过IL-9具体体现。体内除了Th9，Th2、Th17、Treg细胞、NK细胞、肥大细胞也可分泌IL-9^[3]，表明IL-9并不是Th9细胞的特有“专利”。血液恶性病变中，IL-9往往异常升高，是由异常免疫细胞分泌，也并不是由Th9细胞分泌^[27-28]。IL-9促进肿瘤生长的作用大多是在血液恶性疾病中发现，如淋巴瘤患者中发现IL-9可以抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤的增殖，并降低瘤细胞对化疗药物的敏感性^[29]。研究发现，使用相关抗体阻断IL-9或去除IL-9相关基因，肿瘤进展减慢，而抗肿瘤作用升高^{[28, 30]}。

4.   Th9细胞抗肿瘤免疫机制

4.1   Th9细胞促进肿瘤细胞凋亡

Th9细胞可以像CTL一样，高表达granzyme-B，直接作用于靶细胞发挥”杀伤”作用，促进肿瘤凋亡。不过，这种毒性效应却能被相关抑制剂所抑制^[1]。另外，也可以通过分泌细胞因子IL-9直接作用瘤细胞，促进凋亡，但这需要瘤细胞表达相关受体才能起作用^[25]。其他研究发现，IL-9可以通过诱导黑色素瘤细胞促凋亡因子高表达，导致瘤细胞凋亡^[31]。

4.2   诱导其他细胞进入肿瘤组织

有研究发现，小鼠体内注入Th9细胞后，肿瘤组织内白细胞、CD4⁺T、CD8⁺T大量升高，而Tregs/CD8⁺T细胞所占比例却明显下降；相对于对照组，IL-17明显增加，说明Th9细胞可以招募产IL-17的免疫细胞及炎性细胞进入肿瘤组织。Th9细胞可通过诱导肺癌组织上皮细胞CCL20受体和与其配体Ccr6蛋白的表达，促进CTL细胞抗原启动和进入肿瘤组织。主要机制是依赖Ccr6的DCS细胞移入引流淋巴结，激活效应细胞，尤其是CTL细胞进入肿瘤组织^{[2, 32]}。

4.3   分泌相关细胞因子作用于其他细胞

Th9细胞主要分泌细胞因子IL-9作用于其他细胞发挥抗肿瘤免疫作用，也可分泌IL-21、IL-3发挥效应，通过不同的方式作用于其他细胞，其中就包括DCs、CTL、NK、肥大细胞等。

Park等^[33]研究发现，当成熟DCs细胞和Th9细胞一起培养时，DCs生存时间明显较长，而且凋亡速度明显下降，表明Th9细胞能够延长DCs细胞的生存期。检测细胞因子时发现，IL-3和IL-9亦明显增高，分别增加相关抗体后，只有IL-3的抗体才能抑制DCs细胞增长，提示Th9分泌IL-3作用于DCs细胞，主要机制是IL-3能够通过不同的信号通路上调DCs抗凋亡蛋白表达。

Végran等^[34]研究发现，IL-1β能促进Th9细胞的IL-9和IL-21分泌，并可增强Th9的抗癌效果，实验却表明IL-1β是依赖IL-21而发挥抗癌作用而非IL-9，主要机制是IL-21使CTL或NK分泌的IFN-γ增多，这两种细胞缺失会导致Th9细胞的抗癌效果降低。此外，免疫缺陷的小鼠或阻断IFN-γ均可导致Th9细胞失去抑制肿瘤增长的能力。Kim等^[15]研究发现，DTA-1也促进IL-9和IL-21分泌。使用IL-9抗体后能部分消除CTL的抗癌作用，提示DTA-1可能通过IL-9或IL-21增强CTL反应。然后，独立验证CTL细胞和IL-9的关系，使用DAT-1可以使CTL细胞数量增多，而不受IL-9相关抗体的影响，发现CTL细胞上的granzyme B、IFN-γ、TNF-α、CD107a被IL-9抗体所抑制，表明IL-9对CTL的成熟有重要作用。在体外，IL-9却不直接作用于CTL细胞，而是通过增强DCs抗原提呈作用，以及提高相关共刺激和MHC Ⅱ分子表达，而后作用于CTL。Zhao等^[35]研究发现，DCs引起Th9细胞升高后，Th9可以提高肿瘤特异性CTL活性，而阻断IL-9后，相关活性亦受到抑制。上述研究均提示，CTL是Th9细胞重要的效应细胞之一。

肥大细胞也有可能是Th9细胞的效应细胞。Purwar等^[1]研究发现，当Th9细胞发挥抗癌作用时，缺少肥大细胞的小鼠注入IL-9后肿瘤生长会不明显。AbdulWahid等^[26]研究发现，Th9细胞分泌的IL-9能够抑制肥大细胞脱颗粒。同时，Th9的抗肿瘤植入作用也被消除。另外一项平行实验，通过相关试剂消除肥大细胞后，发现注入Th9细胞未能表现出抗肿瘤的效果。不过，也有研究提出不同的意见。其中，Lu等^[2]研究发现，注入Th9细胞的肿瘤组织中未检测到肥大细胞升高，而IL-1β和DAT-1诱导的Th9细胞在肥大细胞缺陷的小鼠身上也能保持其抗癌效果^{[15, 34]}。

5.   影响Th9细胞抗肿瘤作用的相关信号通路

细胞因子或共刺激分子与下游的转录因子构成相当复杂的信号网络，一些细胞因子可通过这些网络影响Th9细胞基因表达。如IL-4可以激活STAT6调控Th9的IL-9基因^[36-37]，OX40对应的是NF-κB^[38]，研究发现TGF-β和Smad均可以诱导Th9细胞分化发育^[39-40]。

有关Th9抗肿瘤作用方面的信号通路研究相对较少。本文已阐述IL-1β可促进Th9细胞基因编码IRF1因子，而该过程主要通过IL-1R-MyD88-STAT1信号通路，IRF1与IL-9和IL-21相关基因互相结合而诱导Th9分化^[34]。

近期研究发现，SIRT1（sirtuin1）缺陷可促进Th9细胞分泌IL-9，并延迟肿瘤进展。研究者探讨IL-4和TGF-β的下游信号PU.1、Smad3、STAT6、STAT5、mTOR、HIF1 α等，发现mTOR-HIF1 α是SIRT1调节Th9所必备的，HIF1 α可直接结合IL-9的基因，促进转录。同时在小鼠和人体均发现SIRT1可以调控Th9细胞的分化，更重要的是，SIRT1上游抑制信号是TAK1（TGF-β activated kinase 1，TAK1）^[41]。一项有关分化抑制因子3（inhibitors of differentiation or DNA binding3，Id3）的研究显示，在Id3基因缺陷的小鼠中，TGF-β和IL-4诱导Th9细胞分化的效果增强，抗肿瘤作用增强。Id3可以负调控转录因子E2A和GATA-3，并阻止其与IL-9的基因启动子结合。Id3上游抑制信号也是TAK1，这表明存在TAK1-Id3-E2A和GATA-3信号通路调控Th9细胞分化^[24]。

Xiao等^[14]研究发现GITR可通过STAT6转录因子和组蛋白乙酰化酶P300诱导Th9分泌IL-9，而另外一个研究团队却发现GITR是经过通路TRAF6-NF-κB，或通过IL-4影响Th9分泌细胞因子。除上述外，也有其他可能的信号通路影响Th9细胞分化。Zhao等^[35]的研究发现，DCs表达的OX40L参与诱导Th9细胞产生的过程，这表明OX40与NF-κB信号通路有可能参与Th9抗肿瘤免疫的过程。Miao等^[25]研究发现，金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）可能通过影响转录因子STAT5、HDAC1、PU.1诱导Th9细胞的分化。上述信号通路具体可见图 2^[3]。

图  2  影响Th9细胞抗肿瘤作用的相关信号通路^[3]

Figure  2.  The related signal transduction pathway of Th9 cells^[3]

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6.   结语

Th9细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用，其抑制肿瘤细胞生长的具体机制相当复杂，主要通过分泌细胞因子发挥效应。其中，IL-9是其最重要的细胞因子，具体机制仍需大量的研究证明。其他因子能够通过不同的信号通路影响Th9细胞的分化，将来可能成为相关治疗靶点。Th9作为新的辅助T细胞，有望成为一种新的治疗策略。