Expression of CD26 in the cancerous tissue and serum of patients with endometrial carcinoma and its diagnostic value
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摘要:目的 探讨人正常子宫内膜增生期、分泌期和子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)的病理不同分级组织中的CD26表达及血液中可溶性CD26(soluble CD26，sCD26)表达对EC发生、发展的诊断价值。方法 收集2014年1月至2015年12月南通大学附属医院行诊断性刮宫或行手术治疗患者的子宫内膜组织标本，其中正常子宫内膜增生期和分泌期标本各30例、Ⅰ型EC的G1、G2、G3级组织标本各40例。应用免疫组织化学法检测组织中的CD26表达和验证其表达水平后，采集2016年1月至2017年9月经门诊体检的健康育龄女性和住院治疗Ⅰ型EC患者的血液标本，其中增生期及分泌期各20例、Ⅰ型EC的G1、G2级各20例、G3级15例。ELISA法检测其血清中sCD26表达。结果 免疫组织化学法检测结果显示正常子宫内膜组织中分泌期的CD26表达水平>增生期(P < 0.05)；Ⅰ型EC的G3级组织中的CD26表达水平>G2级>G1级(P < 0.05)。ELISA结果显示sCD26与Ⅰ型EC病理分级呈正相关(P < 0.05)。结论 Ⅰ型EC组织及血清中的CD26表达水平与疾病进展呈正相关，血清中sCD26表达可作为EC诊断的标记物。Abstract:Objective To explore the diagnostic value of CD26 expression in endometrial carcinoma(EC)by testing CD26 expression innormal proliferative phase, in secretory phase, and in the tissues of different pathological grades of EC; and by investigating the soluble CD26(sCD26)expression in the serum of non-EC patients and EC patients.Methods Endometrial tissue specimens were collectedfrom patients who received diagnostic curettage or surgical treatment for other reasons in the Affiliated Hospital of Nantong University from January 2014 to December 2015.The above endometrial specimens, included 30 specimens of normal proliferative phase, 30specimens of secretory phase, and 120 type I EC tissue samples of G1, G2, and G3 grades.The expression of CD26 among these specimens were detected by immunohistochemistry.After the expression level of the CD26 protein was verified at the tissue, we continuedto collect blood specimens from the outpatients.These patients received physical examination, and included healthy women of childbearing age and type I EC patients.The patients received treatment in our hospital from January 2016 to September 2017.Of theblood samples collected, 20 cases were in proliferative phase and 20 cases were in secretory phase.Samples were also collected frompatients with different grades of EC, including 20 cases of type I EC G1 grades, 20 cases of G2 grades, and 15 cases of G3 grades.Theexpression level of sCD26 in serum was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results According to the results of immunohistochemistry, the order of the CD26 expression levels in normal endometrial tissues were as follows: secretory phase >proliferative phase, with a statistically significant difference observed among these groups(P < 0.05).The order of the CD26 expression levelamong different type 1 EC grades were as follows: G3>G2>G1, with statistically significant differences also observed among thesegroups(P < 0.05).The results of ELISA suggested that the expression level of CD26 in serum was associated with tumor progression, with statistically significant differences observed among the groups(P < 0.05).Conclusion The expression of CD26 in EC tissue and serum is associated with disease progression.The expression of CD26 in serum could be used as a marker for the diagnosis of EC.Keywords: CD26, endometrial carcinoma, diagnosis, markers, tissue, serum
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子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，目前发病率和死亡率呈逐年上升趋势。因EC发病的确切分子机制尚不明确，寻找新的诊断及治疗靶基因对EC的预防、治疗及预后具有重要的意义。
二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPPⅣ)又称CD26是1966年发现的跨膜糖蛋白[1]，为一种含766个氨基酸的单链结构蛋白，其前6个氨基酸残基位于胞浆中，7~28个氨基酸残基由疏水性氨基酸组成并横跨细胞膜，其余部分位于细胞外，可透过细胞膜分泌到膜外而成为可溶性CD26(soluble CD26，sCD26) [2]。同时，CD26具有非酶功能，可与细胞外基质蛋白等相互作用而促进细胞的黏附、迁移和转移[3]。鉴于这些功能，CD26在临床许多疾病的发生、发展，尤其在肿瘤的研究中，其表达水平与肿瘤初始阶段的恶性转化、进展以及免疫调节密切相关[4]。因此，本研究旨在探讨人正常子宫内膜增生期、分泌期及Ⅰ型EC病理不同分级组织中的CD26及血液中的sCD26表达，为进一步阐明CD26在EC发生、发展中的作用及其在临床诊断中的价值提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 临床资料
收集2014年1月至2015年12月南通大学附属医院行诊断性刮宫及行手术治疗的EC病理不同分级患者的组织标本，其中正常子宫内膜增生期和分泌期的组织标本各30例、依据国际妇产科联盟(FIGO)的EC诊治指南(2015年版)收集术后病理证实为Ⅰ型EC的G1、G2及G3级组织标本各40例。应用免疫组织化学法检测后，采集2016年1月至2017年9月经门诊体检的健康育龄女性和住院治疗的Ⅰ型EC患者的血液标本，其中正常子宫内膜增生期和分泌期的血液标本各20例、Ⅰ型EC的G1、G2级各20例、G3级15例(EC血液标本均选择患者月经周期为增生期的病例)。本研究获得南通大学附属医院伦理委员会批准及患者本人知情同意。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色
将组织切片置60℃烤箱烤片2 h脱蜡水化，微波修复，3% H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，羊血清封闭后，加入购自英国Abcam公司的兔抗人CD26一抗(体积稀释比例为1: 800)，湿盒孵育4℃过夜。第二天加入二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，透明封片。使用PBS代替一抗作为阴性对照。
显微镜下随机选取5个高倍视野(×200)进行观察以及结果判定。在每个视野中，计数8条子宫内膜腺体及100个细胞中的阳性细胞数，若视野中不足8条腺体，则对视野中的所有细胞进行计数，判断标准根据阳性细胞的比率和细胞膜着色强度得分进行评价。评估结果采用不同的得分表示：阳性细胞与总细胞数相比的比率 < 5%为0，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分；染色强度中的阴性为0，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每个标本的最终得分为阳性细胞比率的得分×染色强度的得分，得分 < 4分为低表达，得分≥4分为高表达。染色结果由两位有经验的病理科医师双盲下进行独立判定。
1.2.2 ELISA法
经验证CD26表达水平后，分析标本血清中的sCD26表达。对所采集的正常及EC患者的血液样本行3 000 r/min，离心20 min后提取上层血清，-80℃冰箱保存备用。CD26检测ELISA试剂盒购自美国R & D公司，实验步骤按产品说明书进行，在450 nm波长下测各孔的光密度值(OD值)，依据标准品的浓度及对应的OD值绘制标准曲线，计算样品中蛋白浓度，并取平均值。
1.3 统计学分析
应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料均以均数±标准差(x±s)表示，采用独立样本t检验；计数资料间比较采用χ2检验。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组间差异分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 正常子宫内膜组织及Ⅰ型EC组织中的CD26表达水平及与Ⅰ型EC的病理分级的关系
免疫组织化学染色结果显示，CD26蛋白阳性表达的棕黄色颗粒定位于腺体上皮细胞膜及部分细胞质，正常子宫内膜增生期和分泌期组织中CD26阳性率分别为3.33% (1/30)和56.67% (17/30)，子宫内膜分泌期的CD26阳性率(OR为17.00)与正常子宫内膜增生期(OR为1.00)相比明显增高，分泌期的CD26表达水平>增生期，两者的差异具有统计学意义(P < 0.05)；Ⅰ型EC的G1、G2、G3级组织中的CD26阳性率分别为37.50%(15/40)、62.50%(25/40)、85.00%(34/40)，G1、G2及G3级组织中的CD26阳性率(ORG1为11.25、ORG2为18.75及ORG3为25.50)与正常子宫内膜增生期(OR为1.00)比较明显增高，G3级的CD26表达水平> G2级>G1级，差异均具有统计学意义(P < 0.05，图 1，表 1)。CD26表达水平与Ⅰ型EC病理分级呈正相关。
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图 1 免疫组织化学法检测正常子宫内膜及Ⅰ型EC病理不同分级组织中的CD26表达（H & E×200）Figure 1. The expression of CD26 protein was detected in the normal endometrium and different pathological degree of I EC tissues by immunohistochemistry (H & E×200)A. Normal proliferative phase; B. Normal secretion phase; C. G1; D. G2; E. G3表 1 60例正常子宫内膜及120例I型EC病理不同分级组织中的CD26表达Table 1. CD26 expression in 60 normal and 120 different pathological grades of type Ⅰ EC groups
2.2 门诊体检的健康育龄女性及Ⅰ型EC患者的血清中的sCD26表达
采用ELISA检测受试者血清中的sCD26表达水平发现，经门诊体检的健康育龄女性血清中的sCD26表达水平均较低，正常子宫内膜增生期与分泌期的sCD26表达水平进行比较差异无统计学意义(P>0.05)；在Ⅰ型EC患者中，G3级患者血清中的sCD26表达水平与正常子宫内膜增生期的健康育龄女性相比明显增高，两者比较差异具有统计学意义(P < 0.05)；虽Ⅰ型EC的G1级患者血清中的sCD26表达水平较低，但随着EC病理分级增高，sCD26表达水平也明显增加，G3级患者血清中的sCD26表达水平与正常子宫内膜增生期的健康育龄女性相比差异具有统计学意义(P < 0.05，表 2)。
表 2 40例门诊体检的健康育龄女性及55例I型EC病理不同分级患者血清中的sCD26表达Table 2. The level of soluble CD26 in the serum of 40 healthy women and 55 patients with different pathological grades of type Ⅰ EC groups
3. 讨论
近年来，研究表明CD26在肿瘤发生、发展特别是在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着重要作用[4]。但有关CD26表达水平在不同肿瘤中的研究报道却有不同。在某些肿瘤中，CD26作为肿瘤抑制因子发挥抑制作用[5-6]，而在另一些肿瘤中，CD26却又是与肿瘤侵袭、转移密切相关的蛋白[7]。
目前国内外关于CD26与EC发生、发展关系的研究报道较少，国外Khin等[8]通过免疫组织化学法及流式细胞术分别检测了CD26在EC组织中及子宫内膜癌各细胞系中的表达，认为其表达水平与病理分级呈负相关。国内邸石等[9]采用免疫组织化学法检测了子宫内膜样腺癌中的CD26表达，与Khin等[8]得出的结论一致。随着CD26在肿瘤中作用机制的研究深入，越来越多的研究得出与之前研究结果相悖的结论。在对卵巢癌的研究中，既往研究认为[5] CD26高表达可抑制卵巢肿瘤恶性表型，对卵巢具有保护作用。但最近的研究却发现CD26参与卵巢癌的发生发展，且CD26表达水平越高，患者生存期越短，预后越差，并认为CD26为上皮性卵巢癌的潜在预测标记物[7]。同样，在其他肿瘤的研究中也出现与之前研究结果相悖的结论[6]。因此进一步深入探究CD26在EC中的作用及作用机制显得尤为重要。
本课题组的前期研究发现在EC细胞中，当CD26过表达后可促进体外癌细胞的增殖和迁移，而干扰CD26表达后则可以抑制癌细胞的恶性生物学行为[10]。本研究发现，CD26在正常子宫内膜的增生期、分泌期及Ⅰ型EC病理不同分级的组织中均有表达。在正常子宫内膜分泌期组织中的CD26表达水平>增生期，在Ⅰ型EC的G3级组织中的CD26表达水平> G2级>G1级，CD26表达与病理分级呈正相关。本研究与既往报道的EC组织中的CD26表达有所区别[9]，可能与病例选择或检测方法的不同有关，有待于今后增加临床组织样本，尤其是在Ⅱ型EC组织样本中研究分析。
为进一步明确CD26在EC发生、发展中的作用及明确CD26是否可以作为血液的早期检测、病情进展及晚期复发的评估指标，本研究在对临床组织样本研究的基础上，进一步采集了门诊体检的健康育龄女性及病理不同分级的Ⅰ型EC患者的血清标本，检测其血清中的sCD26表达水平。本研究结果发现，处于月经周期增生期及分泌期的正常育龄女性血清中的sCD26表达水平均较低。在Ⅰ型EC患者中随着病理分级的增高，sCD26表达水平逐渐增加，G3级患者血清中的sCD26表达水平明显高于健康育龄女性，差异具有统计学意义。尽管本研究中的sCD26表达水平随着Ⅰ型EC病理分级增高逐渐增加，但G1级患者血清中的sCD26的表达水平与正常子宫内膜增生期的健康育龄女性相比无显著性差异，这一结果还有待于今后进一步标准化样本及增加样本量来进行验证并解释。本研究对Ⅰ型EC患者血清中的sCD26表达水平进行检测，并分析了与EC病理分级的关系，Ⅰ型EC患者血清中的sCD26表达水平增加或可成为临床EC血液检测标记物的一个新方向，对EC的发生、发展具有一定的预测意义。
综上所述，对于Ⅰ型EC患者，EC组织中的CD26表达与病理分级呈正相关，血清中的sCD26表达水平亦与EC疾病的进展密切相关，这将有助于揭示EC发生、发展的机制，为EC的诊断、治疗提供新的参考依据。
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图 1 免疫组织化学法检测正常子宫内膜及Ⅰ型EC病理不同分级组织中的CD26表达（H & E×200）
Figure 1. The expression of CD26 protein was detected in the normal endometrium and different pathological degree of I EC tissues by immunohistochemistry (H & E×200)
A. Normal proliferative phase; B. Normal secretion phase; C. G1; D. G2; E. G3
表 1 60例正常子宫内膜及120例I型EC病理不同分级组织中的CD26表达
Table 1 CD26 expression in 60 normal and 120 different pathological grades of type Ⅰ EC groups
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表 2 40例门诊体检的健康育龄女性及55例I型EC病理不同分级患者血清中的sCD26表达
Table 2 The level of soluble CD26 in the serum of 40 healthy women and 55 patients with different pathological grades of type Ⅰ EC groups
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