Correlations between melanin content and progression and metastasis of malignant melanoma
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摘要:目的 探讨黑色素含量与细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达在恶性黑色素瘤中的临床病理意义。方法 采用组织芯片和免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）方法，检测购于西安艾丽娜生物有限公司189例恶性黑色素瘤患者组织中的黑色素含量和cyclin D1表达。结果 189例恶性黑色素瘤组织中的黑色素高含量者为76例（40.2%），cyclin D1高表达者为80例（45.7%）。黑色素含量与患者的年龄、性别、肿瘤组织来源和有无淋巴结转移无关，与肿瘤的侵袭深度（P=0.001）和临床分期（P=0.038）有关。T3、T4期黑色素瘤中的黑色素含量明显低于T1、T2期。同时，临床分期Ⅲ、Ⅳ期皮肤恶性黑色素瘤中的黑色素含量也明显低于Ⅰ、Ⅱ期。cyclin D1表达与年龄、性别、侵袭深度、临床分期、有无淋巴结转移和肿瘤组织来源无关。黑色素含量和cyclin D1表达在58例淋巴结转移性恶性黑色素瘤中呈负相关（r=-0.271，P=0.039）。结论 黑色素含量下调可能与恶性黑色素瘤的侵袭、进展和转移有关。为恶性黑色素瘤的预后因素分析和病理诊断提供新的依据。Abstract:Objective To investigate the clinical and pathological significance of melanin content and cyclin D1 expression in malignant melanoma.Methods Melanin content and cyclin D1 expression were detected by immunohistochemical staining in one tissue microarray containing 189 specimens of malignant melanoma between January 2001 and December 2014.Results There were 76 cases (40.2%) of high melanin content among 189 malignant melanoma patients, and 80 cases (45.7%) of high expression of cyclin D1. The content of melanin was not correlated with the patients' age, gender, tumor tissue source, and lymph node metastasis, but instead, it was correlated with tumor invasion depth (P=0.001) and clinical stage (P=0.038). The melanin content was much lower in advanced malignant melanoma (stage Ⅲ and Ⅳ or T3 and T4) than in non-advanced melanoma (stageⅠandⅡor T1 and T2). Regarding cyclin D1 expression, there was no significant difference in age, gender, invasion depth (T stage), clinical stage, lymph node metastasis, and tumor tissue source. Melanin content was negatively correlated with cyclin D1 expression in 58 cases of lymph node metastatic malignant melanoma (r=-0.271, P=0.039).Conclusions Melanin content in melanoma tissues may be involved in the invasion, progression, and metastasis of malignant melanoma. The results will provide new evidence for the prognosis and pathological diagnosis of malignant melanoma.
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Keywords:
- malignant melanoma /
- melanin /
- cyclin D1 /
- metastasis /
- immunohistochemistry
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恶性黑色素瘤为最具侵袭性的癌症之一，虽然占所有皮肤恶性肿瘤的比例不足5%，但死亡率极高[1-2]。所以恶性黑色素瘤的早期识别与诊断显得尤为重要。黑色素是由黑色素细胞中的酪氨酸经过一系列酶催化反应合成。据文献报道，皮肤及虹膜黑色素瘤组织中黑色素沉着的减少与较差的预后包括生存率下降有关[3-4]。但是尚无黑色素含量与肿瘤进展和临床分期的相关性的报道。细胞周期蛋白D1（cyclin D1）是细胞从G1期至S期的调节蛋白[5]，在乳腺癌、皮肤恶性黑色素瘤、子宫内膜癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中检测到cyclin D1异常增高[6]。本研究采用组织芯片的免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色方法检测黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表达，并分析其与临床病理指标之间的关系，阐明其在恶性黑色素瘤中的临床意义。
1. 材料与方法
1.1 临床资料
检测购于西安艾丽娜生物有限公司189例恶性黑色素瘤患者组织中的黑色素含量和cyclin D1表达（126例原发病灶，63例转移病灶）。包括男性92例和女性97例，年龄7~88岁（平均53.6岁，标准差13.5岁）。其中，126例原发性恶性黑色素瘤的病例包括91例（72.2%）皮肤恶性黑色素瘤和35例（27.8%）黏膜恶性黑色素瘤。根据美国癌症联合委员会（AJCC）黑色素瘤分期系统，12例（13.2%）、69例（75.8%）、8例（8.8%）和2例（2.2%）患者分别被诊断为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期皮肤恶性黑色素瘤。黏膜恶性黑色素瘤因现有临床标准不统一而未分期。取材后将病理组织用4%多聚甲醛溶液固定并用石蜡包埋，然后将样本制成组织芯片。由两位病理专家通过H & E染色、HMB45和S100的IHC对病理组织做出最终特异性诊断。恶性黑色素瘤的组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司。该研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准并获得患者的知情同意。
1.2 方法
1.2.1 IHC
本研究中采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）方法进行IHC染色。标本切片在60℃烤片1 h，脱蜡、水化、蒸馏水清洗和抗原修复。在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中洗涤后，室温下用3%H2O2覆盖组织10 min。PBS洗涤后用10%正常山羊血清ZLI-9022，购自中杉金桥生物技术有限公司，在37℃下封闭1 h。滴加一抗cyclin D1为1:150；兔抗人单克隆抗体ab134175，购自美国Abcam公司，4℃孵育过夜。隔日，将切片用PBS冲洗后滴加生物素标记的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育20 min；PBS再次洗涤后孵育链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液KIT-9710，购自福州迈新生物技术有限公司。采用3-氨基-9-乙基-1-咔唑（3-amino-9-ethyl-1-carboazole，AEC）显色15 min，苏木精复染，直接用水性封片剂封片。PBS代替一抗作为阴性对照。cyclin D1实验片和阴性对照片显微镜下同时可以观察黑色素的含量。
1.2.2 病理形态计量学分析
由两名病理医生采用双盲法对切片进行评估和IHC评分。参照Weichert等[7]研究方法，通过半定量评分系统评估cyclin D1的IHC染色，黑色素含量也参照下述评分方法评估。阳性肿瘤细胞的染色强度分为0分（无染色）、1分（浅红色）、2分（红色）和3分（深红色）。阳性肿瘤细胞的比例分为0分（无染色）、1分（≤10%）、2分（11%~ 50%）、3分（51%~80%）和4分（>80%）。肿瘤细胞的染色阳性强度和阳性细胞比例相乘后最终的IHC评分为0~12分。其中0~4分为低表达，5~12分为高表达。使用Aperio Image Scope软件和Olympus BX51显微镜，在400倍放大倍率下观察每个样品至少3个区域。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计数资料组间差异的比较采用χ2检验或连续校正χ2检验，计量资料组间差异的比较采用U检验，相关关系使用Spearman相关性分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 黑色素含量与黑色素瘤TNM分期关系
本研究结果显示，189例肿瘤样本中，黑色素高含量者76例，无或低含量者113例。黑色素含量与肿瘤的侵袭深度和临床分期有关，而与患者的年龄、性别、肿瘤组织来源和有无淋巴结转移无关（P>0.05）；T1、T2期黑色素瘤中的黑色素含量明显高于T3、T4期（χ2=8.316，P=0.004，表 1）。采用U检验分析发现Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中的黑色素含量明显高于Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤（P=0.038，图 1A）。将IHC评分作为计量资料，采用U检验得到同样的结果（P=0.001，图 1B）。肿瘤细胞的细胞质、细胞核以及间质区域均可见大量的黑色素沉着，呈棕褐色或黑色（图 2，3），部分遮盖了组织结构和细胞形态。本研究结果提示，黑色素含量可能随着肿瘤的侵袭和进展而降低。
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图 2 原发性恶性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表达（IHC×400）A：cyclin D1高表达，黑色素低含量；B：cyclin D1中度表达，黑色素中度含量；C：cyclin D1低表达，黑色素高含量![]()
图 3 淋巴结转移性恶性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表达（IHC×400）A：cyclin D1高表达，黑色素低含量；B：cyclin D1中度表达，黑色素中度含量；C：cyclin D1低表达，黑色素高含量表 1 黑色素含量和cyclin D1表达在恶性黑色素瘤中与临床病理指标的关系
2.2 cyclin D1表达
cyclin D1蛋白主要表达于肿瘤细胞的细胞核中，着色细胞呈红色（图 2，3），在部分肿瘤细胞的细胞质中也可见阳性染色。189例肿瘤样本中，14例（9例原发病灶、5例转移病灶）因黑色素遮盖肿瘤细胞无法做出IHC阳性判读，其余175例cyclin D1高表达者80例，低表达者95例。cyclin D1表达与年龄、性别、侵袭深度、临床分期、有无淋巴结转移和肿瘤组织来源无关，差异无统计学意义（P>0.05，表 1）。
2.3 恶性黑色素瘤组织中的cyclin D1表达与黑色素含量的相关性分析
在175例肿瘤标本中，采用Spearman相关性分析发现黑色素的表达和cyclin D1阳性表达呈负相关，差异无统计学意义（r=-0.144，P=0.057，图 4A）。然而，黑色素的含量和cyclin D1表达在58例淋巴结转移性恶性黑色素瘤中呈负相关，差异具有统计学意义（r=-0.271，P=0.039，图 4B）。结果提示，黑色素在转移性黑色素瘤中降低可能与肿瘤细胞的增殖加快和转移有关。
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图 4 恶性黑色素瘤组织中cyclin D1表达与黑色素含量的相关性分析A：175例恶性黑色素瘤中黑色素含量和cyclin D1表达呈负相关；B：58例淋巴结转移性恶性黑色素瘤中黑色素含量和cyclin D1表达呈负相关3. 讨论
黑色素瘤细胞为来源于黑色素细胞的恶性肿瘤细胞。合成黑色素为正常黑色素细胞的功能，黑色素的产生在名为黑素体的特定卵圆形细胞器中。在黑素体内合成的黑色素通过树突转运到邻近的角质形成细胞，并在角质形成细胞和黑色素细胞的核周区域积累，被认为可以保护DNA免受紫外线的损伤[8]。黑色素细胞恶变后产生黑色素的功能、黑色素的代谢以及其病理意义研究较为有限。
本研究结果显示，189例恶性黑色素瘤患者组织中的黑色素高含量者为76例（40.2%）。黑色素含量与患者的年龄、性别、肿瘤组织来源和有无淋巴结转移无关，与肿瘤的侵袭深度（P=0.001）和临床分期（P=0.038）有关，提示黑色素含量可能随着肿瘤的侵袭和进展而下调。目前，国内外关于黑色素含量与恶性黑色素瘤的分期和转移相关性的研究报道较少。Moreau等[3]分析了2000年至2009年美国18个州的侵袭性黑色素瘤病例，研究发现无色素性黑色素瘤的5年生存率（overall survival，OS）明显低于有色素性黑色素瘤。Brouwer等[4]在444例结膜黑色素瘤中使用单变量和多变量回归分析研究了虹膜颜色、肤色和肿瘤色素沉着与临床参数和结果之间的关系，发现肿瘤低色素沉着与转移形成有关，且这类患者预后较差。Brozyna等[9]分析了黑色素瘤患者的OS和无病生存期（disease-free survival，DFS）与肿瘤色素沉着程度的关系，发现在患有转移性疾病的患者中，无黑色素沉着患者的DFS和OS短于黑色素沉着患者。上述研究缺乏黑色素含量的半定量和进一步研究。本研究与上述研究的差异为：1）本研究在病理切片中将黑色素含量根据镜下观察进行半定量，而上述研究无；2）本研究首次将黑色素含量与临床分期进行相关性分析，而非分析具体指标相关性；3）本研究还发现淋巴结转移黑色素瘤中黑色素含量与cyclin D1的表达呈负相关。本研究的局限性在于因为缺失随访数据而未作生存率分析，但是现有研究结果表明无或低色素沉着的肿瘤多为恶性程度较高的Ⅲ、Ⅳ期，该结果间接提示无或低黑色素含量的患者预后可能不良。
cyclin D1作为细胞周期的关键调节分子，在多种肿瘤中发现其过表达可致细胞增殖失控[10]。Oba等[11]采用IHC法检测78例原发性黑素瘤、24例转移性病灶和42例良性痣中cyclin D1的表达，结果显示原发性黑素瘤中cyclin D1的表达明显高于良性痣，cyclin D1阳性率在原发性黑色素瘤中的比例高于转移性黑色素瘤。但是这与另外两项研究结果不一致，Georgieva等[12]研究发现，cyclin D1表达与组织病理学分期无关。Oba等[11]研究发现，Breslow深度和cyclin D1表达水平无关系，所有原发性黑素瘤的cyclin D1表达水平与转移的存在并无关。cyclin D1表达并不能预测浅表和原发性结节性黑素瘤的DFS或OS[11-13]。上述研究结果表明，cyclin D1在原发性黑素瘤转移的进展过程中作用存在争议。本研究结果显示，cyclin D1的表达与年龄、性别、侵袭深度、临床分期、有无淋巴结转移和肿瘤组织来源无关，与上述部分研究结论相一致。黑色素的含量与cyclin D1的表达在淋巴结转移性恶性黑色素瘤中呈负相关，提示黑色素的降低可能参与转移瘤细胞的增殖。
在临床病理诊断中，IHC染色为不可或缺的环节。在过氧化物酶法染色过程的最后一步通常会使用IHC染色剂3，3-二氨基苯联胺（diaminobenzidine，DAB）显色，其终产物呈棕色。然而，黑色素的颜色也是棕色或黑色，且黑色素属于组织内源性色素，标本经常规固定、脱水、透明、浸蜡和包埋等一系列处理后，黑色素依然存于组织中。针对黑色素干扰病理诊断的问题，研究者会使用强氧化剂将黑色素脱色后再进行后续的IHC染色和诊断[14]。通过脱色素方法虽然能够将覆盖于组织的大部分色素脱去，但是同时黑色素的重要价值也被忽略。本研究中使用的IHC显色剂AEC终产物颜色为红色[15]，在显微镜下可以明显的与黑色素区分，故在同一张切片上可以同时对黑色素和cyclin D1进行判读。由于既往对于黑色素的诊断意义缺少认识，病理组织中黑色素含量易被忽略。本研究结果显示，采用组织切片预估黑色素含量是必要且可行的，对于黑色素瘤的预后判断是有意义的。未来亟需黑色素含量与黑色素瘤患者OS的关系以及黑色素沉着机制与肿瘤生长和侵袭的进一步研究。此外，如果患者的病理组织表现出低黑色素含量和cyclin D1高表达，结合其他临床检验结果预估肿瘤恶性程度较高，预后不良，手术应尽早切除并进行可疑淋巴结清扫。
综上所述，黑色素含量与恶性黑色素瘤的侵袭和进展相关，cyclin D1在恶性黑色素瘤中的表达与临床病理指标之间无显著性差异，但是在淋巴结转移性黑色素瘤中，cyclin D1的表达与黑色素含量呈负相关，其结合在指导恶性黑色素瘤的病理诊断和预后分析方面可能具有重要意义。
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图 2 原发性恶性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表达（IHC×400）
A：cyclin D1高表达，黑色素低含量；B：cyclin D1中度表达，黑色素中度含量；C：cyclin D1低表达，黑色素高含量
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图 3 淋巴结转移性恶性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表达（IHC×400）
A：cyclin D1高表达，黑色素低含量；B：cyclin D1中度表达，黑色素中度含量；C：cyclin D1低表达，黑色素高含量
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图 4 恶性黑色素瘤组织中cyclin D1表达与黑色素含量的相关性分析
A：175例恶性黑色素瘤中黑色素含量和cyclin D1表达呈负相关；B：58例淋巴结转移性恶性黑色素瘤中黑色素含量和cyclin D1表达呈负相关
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