皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）是我国常见的皮肤恶性肿瘤，具有高度的侵袭能力，可能与紫外照射损伤、免疫抑制及其他皮肤疾病有关^[1]。因此，寻找其发生过程中发挥关键作用的分子对其治疗是必要的。研究发现微小RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤的发生发展中起着重要的作用^[2]。

miRNA是一类比较保守的单链非编码小RNA分子，主要通过与靶基因mRNA 3'UTR结合，在转录后水平调控基因的表达^{[3, 4]}。miRNA参与一系列的生理过程，如生长、发育、分化及凋亡^[5]。研究发现约50% miRNA基因定位于染色体上肿瘤基因相关区域，并且在肿瘤中经常伴随着miRNA的异常表达^[6]。关于miRNA与皮肤鳞癌的研究在国内外报道甚少，有研究表明在皮肤鳞癌中miR-125b通过靶定MMP-13抑制鳞癌细胞的生长和侵袭迁移^[7]。此外，通过对皮肤鳞癌和其他皮肤肿瘤患者中miRNA表达水平的分析，发现miR-31在皮肤鳞癌中高表达^[8]。然而，关于miR-31在皮肤鳞癌中的作用还未明确。

本研究探索了miR-31对细胞增殖以及肿瘤生长的影响，并对其靶基因进行验证。

1.   材料与方法

1.1   材料

本研究20对皮肤鳞癌和癌旁正常组织来自2011年1月至2013年6月重庆医科大学永川医院收治患者，并得到患者的知情同意。鳞癌细胞A431和SLC-1的培养液是含有10% FBS的DMEM（Gibco公司）。脂质体Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司，ASO和siRNA购自上海吉玛公司。兔抗LATS2和GAPDH抗体购自Abcam公司。RNA提取试剂盒购自Qiagen公司，反转录酶购自Fermentas公司，实时定量PCR的2×SYBR Green Master Mix购自Takara公司。

1.2   方法

1.2.1   细胞转染

按照脂质体的说明进行。细胞转染4 h后，换含有血清的培养液，在37℃、5% CO2的孵箱中继续培养。

1.2.2   平板克隆形成实验

将转染的细胞种到12孔板，每隔3天换液至到大部分克隆形成。用PBS清洗后5%浓度结晶紫染色，并进行计数。

1.2.3   体外成瘤实验

裸鼠购自北京维通利华有限责任公司（动物合格证号：SCXK（京）2013-0002），并得到动物管理委员会的许可。裸鼠在无菌的条件下正常饮食，将10⁶个转染的鳞癌细胞重悬在100 μL无血清培养液中，经皮下注射途径植入裸鼠。大概3周后，将小鼠麻醉处死取出肿瘤组织，并量取体积。体积=（长×宽²）/2。

1.2.4   Western印迹

细胞中转染LATS2的siRNA（20 nM）以及对照，48 h后提取蛋白进行Western印迹分析LATS2的水平。转染48 h后，用PBS洗细胞后用RIPA缓冲液裂解细胞。利用BCA法进行蛋白浓度测定，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE胶分析。最后利用ECL显影，并分析条带的强度。以GAPDH作为内参。

1.2.5   RNA提取和实时定量PCR

利用RNA提取试剂盒进行RNA提取，采用NanoDrop ND-1000分光光度计测定RNA的浓度。取500 ng RNA进行cDNA的合成后进行PCR反应。反应条件是：95℃ 30 s，之后40个循环95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s。以U6 RNA和β-actin作为内参。

1.2.6   免疫组织化学

将石蜡包埋的组织切片进行脱蜡水合处理，3%H₂O₂室温孵育5 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min后，用5%山羊血清封闭10 min，滴加一抗工作液孵育1 h。然后用生物素标记的二抗工作液37℃孵育10 min。最后滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。PBS冲洗后显色剂显色3 min，在显微镜下观察。

1.2.7   GFP报告载体实验

将含有miR-31结合位点的LATS2 3'UTR克隆到pcDNA3/GFP载体的GFP下游。在细胞中共转染miR-31 ASO和LATS2 3'UTR，同时转染RFP质粒作为内参。转染48 h后，用RIPA裂解细胞提取蛋白，荧光分光光度计检测细胞GFP荧光强度。

1.3   统计学处理

用SPSS 18.0软件进行统计分析，比较两组数据间的差异采用双侧样本的Student's t检验，比较相关性采用Pearson相关系数分析。P < 0.05被认为是差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   平板克隆形成实验分析miR-31对细胞生长的影响

将miR-31 ASO以及对照转染A431和SLC-1细胞，利用平板克隆形成实验检测细胞生长的情况。转染miR-31 ASO的A431细胞克隆数较对照组减少约50%，且差异具有统计学意义（P < 0.05）；在SLC-1细胞中也得到了类似的结果。

2.2   体外成瘤实验分析miR-31对肿瘤生长的影响

将转染miR-31 ASO以及对照的细胞经皮下注射入裸鼠体内，利用体内成瘤模型检测miR-31对肿瘤生长的影响。结果显示转染miR-31 ASO的鳞癌细胞成瘤能力降低，肿瘤体积明显小于对照组（图 1），且差异具有统计学意义（P < 0.05）。

图  1  体外成瘤实验检测miR-31对鳞癌生长的影响

*P < 0.05

Figure  1.  In vitro tumor formation assay indicates that miR-31 inhibition suppresses cSCC growth

A. In vitro tumor formation; B. Volume assays of the tumors

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2.3   Western blot印迹检测miR-31对LATS2蛋白水平的影响

研究证实miR-31可以靶定抑癌基因LATS2和PPP2R2A^[9]。为了检测在皮肤鳞癌中miR-31是否也通过这两个基因发挥作用，首先通过Western印迹检测miR-31 ASO对LATS2和PPP2R2A表达水平的影响。实验显示鳞癌细胞转染miR-31 ASO后使LATS2的水平升高约1.5倍，差异具有统计学意义（图 2，P < 0.05），而对PPP2R2A的表达水平无影响（P>0.05）。

图  2  Western blot检测miR-31对候选靶基因蛋白表达的影响

*P < 0.05

Figure  2.  Western blot shows that miR-31 inhibition increases LATS2 protein levels

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2.4   生物信息学预测miR-31的候选靶基因

利用生物信息学方法（TargetScan以及Pictar预测网站）对miR-31与候选靶基因的结合位点进行验证，图 3显示miR-31与候选靶基因LATS2 3'UTR的结合位点互补。

图  3  生物信息学预测miR-31的靶基因

Figure  3.  Bioinformatics indicates that LATS2 3'UTR has binding sites with miR-31

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2.5   GFP报告载体实验验证miR-31的靶基因

在A431和SLC-1细胞中共转染miR-31 ASO和野生型或者突变型的LATS2 3'UTR（突变位点如图 3所示），通过GFP报告载体实验检测miR-31对LATS2 3'UTR荧光强度的影响。结果显示转染miR-31 ASO的细胞中LATS2 3'UTR的荧光强度较对照组增强50%（图 4），且差异具有统计学意义（P < 0.05），且在两种鳞癌细胞中结果一致。然而miR-31 ASO对突变的3'UTR荧光强度无明显影响（P>0.05，图 4）。

图  4  GFP报告实验验证miR-31的靶基因

*P < 0.05

Figure  4.  GFP reporter assay shows that miR-31 inhibition increases the GFP intensity of LATS2 3'UTR

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2.6   Western blot检测siRNA对LATS2表达水平的影响

在A431和SLC-1细胞中转染LATS2 siRNA以及对照，转染48 h后利用Western blot检测细胞中LATS2蛋白水平。结果显示转染LATS2 siRNA的细胞中LATS2的水平较对照组降低约80%，且差异具有统计学意义（图 5，P < 0.05）。

图  5  Western blot检测LATS2的表达以及平板克隆形成实验检测细胞生长

*P < 0.05

Figure  5.  Western blot shows that LATS2 expression is repressed by introduction of siRNA against LATS2

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2.7   平板克隆形成实验分析LATS2对细胞生长的影响

在A431和SLC-1细胞中转染LATS2 siRNA以及对照，利用平板克隆形成实验检测细胞的生长情况，结果显示转染LATS2 siRNA的细胞克隆数分别升高约70%和1.3倍，且差异具有统计学意义（图 6，P < 0.05）。

图  6  平板克隆形成实验检测LATS2对细胞生长的影响

*P < 0.05

Figure  6.  Colony formation assay shows that knocking down of LATS2 increases the number of colonies

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2.8   实时定量PCR分析miR-31的表达水平

利用实时定量PCR检测miR-31和靶基因在鳞癌以及癌旁正常组织中的表达水平。图 7显示，与癌旁正常组织相比，鳞癌组织中miR-31的水平升高约2.5倍，差异具有统计学意义（P < 0.05），并且miR-31与LATS2的表达呈负相关（P < 0.05）。

图  7  实时定量PCR检测miR-31和LATS2在鳞癌组织和正常对照中的表达水平

*P < 0.05

Figure  7.  Real-time PCR shows that miR-31 is upregulated in cSCC tissues, and an inverse relationship exists between miR-31 and LATS2 expression levels

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2.9   免疫组织化学法检测LATS2在鳞癌组织中的表达

利用免疫组织化学检测LATS2在鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达水平。图 8显示，与正常组织相比，皮肤鳞癌组织中LATS2的表达水平明显降低。

图  8  免疫组织化学检测LATS2在鳞癌组织和正常对照中的表达水平（SP×200）

Figure  8.  Immunohistochemistry shows that LATS2 is downregulated in cSCC tissues(SP×200)

A. Nomal tissues; B. Cancer tissues

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3.   讨论

本研究结果发现miR-31在鳞癌组织中高表达，抑制miR-31的表达后细胞克隆形成能力下降，肿瘤生长受抑制。已有研究发现miR-31可促进血管平滑肌细胞生长^[10]。此外，在食管鳞癌和结肠癌中，miR-31也是高表达，并且与肿瘤的进展程度相关^[11-12]，这些均提示miR-31发挥着癌基因的角色。

miRNA与靶基因3'UTR的不完全互补，是导致一个miRNA调控多个靶基因表达的原因之一^[13]。研究证实在肺癌和血管平滑肌细胞中miR-31可以通过靶定PPP2R2A和LATS2参与细胞的生长。在本研究中，抑制miR-31的表达后，LATS2蛋白水平升高，而PPP2R2A的表达不受影响。这可能是PPP2R2A的3'UTR在不同的肿瘤细胞中有差异，导致miRNA的抑制作用消失。此外，通过GFP报告实验进一步验证LATS2是miR-31的直接靶基因，miR-31通过与其3'UTR直接结合而抑制其表达。

LATS2定位于13号染色体，可编码丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。研究发现该酶属于Hippo肿瘤抑制信号途径的成员，可以通过磷酸化的形式使癌基因YAP失活，从而抑制恶性间皮瘤细胞的生长^[14]。在胃癌中，癌基因miR-372可以通过抑制LATS2的表达从而抑制细胞的生长，促进细胞凋亡^[15]。说明LATS2在抑制肿瘤细胞生长中起着重要的作用。本研究通过免疫组织化学及实时定量PCR发现LATS2在皮肤鳞癌组织中表达降低。敲除LATS2的表达后细胞的克隆形成能力增强，与抑制miR-31的作用相反，进一步证实LATS2是miR-31的靶基因。

总之，本研究在皮肤鳞癌中miR-31通过抑制LATS2的表达调控鳞癌的生长，发挥着癌基因的作用，可为皮肤鳞癌的分子治疗提供更多的依据和理论基础。