Relationship between expression of PD-L1 and microsatellite instability of colorectal cancer and its significance
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摘要:目的 研究PD-L1在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)中的表达及临床意义.方法 选取2015年1月至2016年1月在郑州大学附属肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者210例，分为微卫星高度不稳定（high-frequency microsatellite instability，MSI-H）、微卫星低度不稳定（low-frequency microsatellite instability，MSI-L）、微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）3个组，采用免疫组织化学法检测各组织标本中细胞程序性死亡配体1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表达，分析PD-L1在各型CRC中的表达特点。结果 PD-L1在低分化CRC中的表达高于中、高分化CRC（P＜0.05），PD-L1在MSI-H的CRC中阳性率为75.8%，在MSIL/MSS中的阳性率为9.3%，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 PD-L1在部分CRC癌组织中阳性表达，尤其是在MSIH的CRC阳性率显著高于MSI-L及MSS的CRC。PD-L1阻断剂对MSI-H的CRC患者疗效可能更好。Abstract:Objective To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 in colorectal cancer(CRC).Methods A total of210 CRC patients who accepted radical surgery in our hospital from January 2015 to January 2016 were divided into three groups, namely, high-frequency microsatellite instability(MSI-H), low-frequency microsatellite instability(MSI-L), and microsatellite stable(MSS).The expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry, and the expression characteristics of PD-L1 in different typesof CRC were analyzed.Results CRC cases with low differentiation had a higher expression of PD-L1 than CRC patients with high differentiation(P < 0.05).PD-L1 had a positive rate of 75.8% in the MSI-H group and a rate of 9.3% in the MSI-L and MSS groups, wherein thedifference between the two groups was statistically significant(P < 0.05).Conclusion D-L1 was positively expressed in some CRC tumor tissues, and its positive rate was significantly higher in MSI-H than in MSI-L and MSS.The therapeutic effect of a PD-L1 blocker forpatients with MSI-H CRC might be preferable.
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Keywords:
- PD-L1 /
- colorectal cancer /
- immunohistochemistry /
- significance
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结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，目前其发病率居全球所有恶性肿瘤的第3位，在中国的发病率也呈逐步上升趋势[1-2]。除了传统的手术和放化疗，近年来分子靶向治疗在特定患者人群中表现出显著的疗效。细胞程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）能够抑制T细胞的活化与增殖，诱导T细胞凋亡，从而维持机体的免疫平衡，避免自身的免疫损伤[3-4]。PD-L1抗体可用于治疗多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、卵巢癌等[4-6]。本研究探讨PD-L1在CRC中的表达及临床意义，以期为PD-L1在结直肠癌个体化精准治疗的临床应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 临床资料
收集2015年1月至2016年1月在郑州大学附属肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者210例临床资料，手术前均未接受任何治疗，排除标准：遗传性腺瘤性息肉病及遗传性非息肉性结直肠癌患者。入组患者手术石蜡组织标本，包括210例肿瘤组织、50例癌旁正常组织（距离癌变组织边缘直径＞5 cm，术后切缘病理未见肿瘤细胞）。本研究得到郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。入组患者的基本资料：男性118例，女性92例；年龄31~85岁，平均年龄63.5岁；右半结肠（升结肠和右半横结肠）43例，左半结肠（左半横结肠，降结肠和乙状结肠）32例，直肠135例。病理分期标准按照美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（UICC）结直肠癌第7版TNM分期标准[7]。
1.1.2 取材和病理切片的制备
手术切除新鲜结直肠组织标本后送病理科，每例患者留取癌组织及癌旁组织标本各一块，以10%福尔马林固定溶液固定24 h以上，制备石蜡包块，制作连续切片厚度4 μm，分别常规以苏木素-伊红（HE）染色、PD-L1免疫组织化学染色，显微镜下观察并拍照。
1.2 方法
1.2.1 MSI的检测
本研究使用MSI检测试剂盒检测贝斯塔遗传标记（Bethesda Marker）：Bat25、Bat26、D5S346、D2S123和D17S250共5个位点，正向引物标记荧光，对同一患者的肿瘤组织和正常黏膜组织的DNA进行PCR扩增，再用毛细管电泳检测扩增的产物，判断检测的肿瘤组织和正常黏膜组织是否存在微卫星不稳定性。5对引物来自美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因库，上游引物5'端分别作3种不同颜色的荧光标记。相对分子量标准采用美国ABI公司的GS-500LIZ Size Standard内标。同色引物扩增产物长度有别，可同时对多个位点进行片段分析，引物序列见表 1。
表 1 MSI引物及特征Table 1. MST primers and characteristics
1.2.2 免疫组织化学染色法
切除的组织标本用甲醛溶液固定，石蜡包埋，组织切片的厚度为4 μm，将其置于玻璃片上，用二甲苯脱蜡，在梯度乙醇内水化，在900 W微波加热2 s，进行抗原修复后，于0.3%的H2O2液中浸泡30 min阻断内源性抗原，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗3次，用10%正常的血清阻断背景非特异性的染色，加一抗置于湿盒内孵育过夜。一抗为兔抗人PD-L1单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），1: 100稀释。生物素包被的鼠抗兔抗体孵育30 min后使用PBS洗3次，再用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育30 min，然后使用苏木素复染。以正常小鼠的IgG代替一抗作为阴性对照。
1.2.3 免疫组织化学结果判读标准
本研究使用免疫组织化学SP法检测PD-L1在CRC癌组织中的表情况，参考杨军等[8]的免疫组织化学检测结果判读方法对结果进行判断统计。免疫组织化学切片由病理科医师判读，PD-L1定位于肿瘤细胞膜或细胞浆，当所观察指标定位部位出现棕黄色颗粒为阳性表达。直接计算阳性细胞数（或面积）占视野下或整张切片内同类细胞数（或面积）的百分比进行分级。阴性（0）：无着色；弱阳性（+）：任何比例的细胞呈现微弱、不完整膜着色；阳性（++）：＞10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色；强阳性（+++）：＞30%的细胞呈现强、完整膜棕褐着色。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，定性资料分析方法主要使用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 MSI在CRC中的检测结果
与正常结直肠黏膜对比，210例CRC癌组织标本中MSI-H的发生率为13.3%，MSI-L的发生率为0.9%，MSS的发生率为85.7%，其中28例MSI-H的CRC同时存在Bat26与Bat25的位点改变，10例存在D2S123位点的改变，11例存在D17S250位点的改变，4例存在D5S346位点的改变，只有2例5个位点均存在改变（表 2）。
表 2 CRC的MSI检测结果Table 2. Detection of MSI in CRC
2.2 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达
PD-L1在CRC癌组织的阳性率为18.6%，对照组的50例癌旁正常黏膜PD-L1阳性率为6.0%，统计分析显示PD-L1在CRC中肿瘤组织的阳性率高于癌旁正常组织（P＜0.05，表 3，图 1）。
表 3 PD-L1在CRC中肿瘤组织与癌旁组织中的表达Table 3. Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC
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图 1 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达Figure 1. Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRCA. Normal colon tissue (H&E staining); B. Normal colon tissue (PD-L1 staining); C. Cancer tissue (H&E staining); D. cancer tissue (PD-L1 staining, ×200)2.3 PD-L1与CRC临床病理特征的相关性
分析显示PD-L1在CRC中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤部位、组织学类型、浸润深度和病理分期之间差异无统计学意义（P＜0.05）；仅在分化程度上差异具有统计学意义（表 4，P＜0.05）。
表 4 PD-L1与CRC的临床病理特征关系Table 4. Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC
2.4 PD-L1在MSI-H的CRC和MSI-L/MSS的CRC中的表达情况
在MSI-H的CRC中，PD-L1阳性率为75.8%；在MSI-L/MSS的CRC中，PD-L1阳性率为9.3%，两组比较差异具有统计学意义（表 5，P＜0.05）。
表 5 PD-L1在MSI-CRC中的表达Table 5. Expression of PD-L1 in MSI-CRC
3. 讨论
CRC是全球常见的消化道恶性肿瘤，与西方国家相比，CRC在中国的发病率相对较低，但是随着社会经济的发展、生活环境的改变、人民生活习惯的变化等，该病在国内的发病率逐年上升，且趋于年轻化[9]。因此，研究CRC的发病机制、治疗和预防，对降低CRC的发病具有重要的临床价值。近几年来，随着对肿瘤发病机制的研究不断深入，对癌基因和抑癌基因的进一步了解，CRC的治疗已经从外科治疗为主、放化疗为辅的综合治疗转向了精准化、个体化治疗理念，应运而生的生物治疗、基因治疗、免疫治疗越来越受到重视[10-13]。
本研究结果显示，PD-L1在癌组织与正常组织之间表达存在显著性差异，PD-L1在癌组织中均存在阳性表达率升高。PD-L1在CRC表达的临床病理特征仅与分化程度相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。
PD-L1在MSS的CRC中，PD-L1的阳性表达与MSS的CRC有无淋巴结转移无关（P＞0.05），与病理分期无关（P＞0.05），但PD-L1在分化程度低的MSS的CRC中阳性率显著高于中、高分化组（P＜0.05）。
进一步分析发现PD-L1在MSS的CRC中阳性表达率为9.3%，而Droeser等[14]研究显示，PD-L1在MSS的CRC中表达率为37%，造成这种差异的原因，可能是入组病例数量过少，但在PD-L1表达与肿瘤的低分化，缺少淋巴结转移等临床病理特征与本研究相同，而对于病理分期早的特点在本研究中并未得出相同的结论。
PD-L1是细胞毒性免疫应答的关键抑制剂，肿瘤细胞上PD-L1的表达可以被免疫微环境诱导，导致肿瘤的免疫逃避以及预后不良。Llosa等[15]研究发现，在CRC的免疫微环境中富含活化的Th1、CTL（细胞毒性T淋巴细胞），在错配修复中存在缺陷，为了平衡这种活性Th1/CTL的微环境，MSI CRC选择性地上调某些免疫检查点的表达，其中就包括有PD-L1。Rosenbaum等[16]对结直肠癌的研究发现，PD-L1抑制反应与微卫星不稳定性相关。本研究中，MSI-H的CRC患者癌组织中PD-L1中呈高表达（PD-L1阳性为75.8%），与上述研究成果一致，同时进一步证实了Li等[17]的研究结果，即PD-L1与CRC患者的预后有关。虽然目前国内的相关研究较少，但是本研究结果为这一设想提供了理论依据，且相关的临床研究仍在继续开展中。
综上所述，本研究对PD-L1在结直肠癌中的表达进行了初步研究，证实PD-L1在部分CRC癌组织中阳性表达，尤其是在MSI-H的CRC患者中其阳性率显著高于MSI-L及MSS的CRC。根据本研究结果推论，在临床实践中，PD-L1阻断剂对MSI-H的CRC患者疗效可能更好。
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图 1 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达
Figure 1. Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC
A. Normal colon tissue (H&E staining); B. Normal colon tissue (PD-L1 staining); C. Cancer tissue (H&E staining); D. cancer tissue (PD-L1 staining, ×200)
表 3 PD-L1在CRC中肿瘤组织与癌旁组织中的表达
Table 3 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC
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表 4 PD-L1与CRC的临床病理特征关系
Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC
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