The value of immunohistochemical indicators in staging and grading of non-muscle invasive bladder cancer
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摘要:目的 探讨Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2与非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)分期、病理分级的关系。方法 回顾性分析2015年1月至2016年12月184例就诊于天津医科大学肿瘤医院行经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of the bladder，TURBT)，术后病理证实为Ta、T1期NMIBC患者的临床病理资料。利用免疫组织化学法检测癌组织中的Ki-67、TP53、Cyclin D1和HER-2表达，并对其与NMIBC分期、病理分级关系进行单因素分析，采用Logistic多因素回归模型分析影响NMIBC分期、病理分级的独立因素，计算并比较其灵敏度及特异度。结果 单因素分析显示肿瘤大小与NMIBC的T1期及病理G3级呈正相关(P＜0.05)；NMIBC的T1期及病理G3级组织中的Ki-67、HER-2高表达，与肿瘤分期及病理分级均呈正相关(P＜0.05)；NMIBC的Ta期及病理G1、G2级组织中的Cyclin D1高表达，与肿瘤分期及病理分级呈负相关(P＜0.05)。Logistic多因素分析显示，Ki-67高表达、Cyclin D1低表达为T1期NMIBC的独立预测因素；Ki-67高表达、HER-2高表达、Cyclin D1低表达为病理G3级NMIBC的独立预测因素。在NMIBC组织中Ki-67对预测分期和病理分级均有较高的灵敏度和特异度，灵敏度为81.40% (48/59)和76.80% (96/125)，特异度为76.83% (63/82)和86.30% (88/102)。结论 检测Ki-67表达可以更加准确地判断NMIBC分期及病理分级，为及时有效地治疗提供参考依据。Abstract:Objective To evaluate the staging and grading valut of Ki-67, TP53, Cyclin D1, HER-2 in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC).Methods Retrospective analysis was performed on the clinicopathologic characteristics of 184 Ta, T1 stage NMIBC patients who underwent transurethral resection of the bladder (TURBT) at the Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital from January 2015 to December 2016. The expression of Ki-67, TP53, Cyclin D1 and HER-2 was evaluated by immunohistochemical assay. Then, the association between immunohistochemical indicators expression, staging and grading of NMIBC were assessed by univariate analysis. The independent factors of staging and grading in NMIBC were assessed by multivariate Logistic analysis, and their sensitivity and specificity were compared.Results Univariate analysis showed a positively correlation between tumor size and T1 and G3 of NMIBC (P < 0.05). The high expression of Ki-67 and HER-2 was positively correlated with tumor staging and grading (P < 0.05) in T1, G3 NMIBC tissues. The high expression of CyclinD1 was negatively correlated with tumor staging and grading (P < 0.05) in Ta stage tissues. Logistic multivariate analysis showed that high expression of Ki-67 and low expression of Cyclin D1 were independent predictors of T1 in NMIBC. High expression of Ki-67, high expression of HER-2 and low expression of Cyclin D1 were independent predictors of G3 in NMIBC. The Ki-67 expression had high sensitivity and specificity for predicting tumor staging and grading in NMIBC. The sensitivity were 81.40% (48/59) and 76.80% (96/125), and the specificity were 76.83% (63/82) and 86.30% (88/102), respectively.Conclusions Detection of Ki-67 expression could predict staging and grading in NMIBC, and provide the basis for appropriate treatment.
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Keywords:
- non-muscle invasive bladder cancer /
- immunohistochemistry /
- stage /
- pathological grade /
- sensitivity /
- specificity
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膀胱癌在世界恶性肿瘤中位居第9位，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。在美国，每年约有7.4万例患者被诊断为膀胱癌，男、女性膀胱癌发病率分别占男、女性恶性肿瘤发病率的第4位及第11位[1]。在中国，每年约有5.6万例膀胱癌新发病例，2.6万例患者死于该病，发病率呈逐年上升趋势。膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)。NMIBC分期、病理分级是疾病复发进展的关键预测因子，同时也是指导患者个体化精准治疗的关键。病理学诊断是判断NMIBC分期、病理分级的金标准，但标本质量易受经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of the bladder，TURBT)的影响，如膀胱肿瘤组织被烧灼、电切未能切到膀胱肌层等[2]，而病理学专家判断NMIBC的分期、病理分级中也存在明显的差异[3]。因此迫切需要客观的临床指标以有效地判断NMIBC分期与病理分级。
近年来，随着分子生物学技术的发展，许多与NMIBC相关的免疫组织化学指标逐渐被应用于临床。目前研究证实Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2是肿瘤进展的重要预测指标[4]，但预测其与NMIBC分期及病理分级关系的研究鲜见。本研究旨在通过分析NMIBC患者的临床病理资料及Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2表达与肿瘤分期、病理分级之间的关系，探究判断NMIBC分期、病理分级的客观指标，为临床诊断及治疗提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 病例资料
收集2015年1月至2016年12月184例就诊于天津医科大学肿瘤医院行TURBT且术后经病理证实为Ta、T1期NMIBC患者的临床病理资料。患者年龄为26~90岁，平均年龄58岁。患者的肿瘤大小＜3 cm为142例(77.2%)，肿瘤大小≥3 cm为42例(22.8%)；肿瘤单发113例(61.4%)，肿瘤多发71例(38.6%)；肿瘤初发149例(81.0%)，肿瘤复发35例(19.0%)。术后病理G1与G2级102例(55.4%)，G3级82例(44.6%)；Ta期125例(67.9%)，T1期59例(32.1%)。
1.2 方法
采用免疫组织化学法检测病理组织切片中Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2表达。SP试剂盒、兔抗人Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2单克隆抗体及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，实验步骤严格按照试剂说明进行。采用双盲法，由两位资深病理医师分别阅片。在显微镜下随机选取5个不同视野(× 400)，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞的百分比(阳性细胞数/总细胞数×100%)。阳性细胞的百分比大于最佳临界点者定义为高表达，阳性细胞的百分比小于最佳临界点者定义为低表达。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。采用ROC曲线法确定免疫组织化学各指标的最佳临界值。单因素分析采用χ2检验，多因素分析采用Logistic风险回归模型，计算并比较变量的灵敏度及特异度。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 免疫组织化学法检测各指标的表达
利用ROC曲线确定Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2阳性细胞百分比的最佳临界点，分别为25%、75%、45%、70%。Ki-67高表达阳性率为41.8% (77/184)，TP53高表达阳性率为27.7% (51/184)，Cyclin D1高表达阳性率为84.2% (155/184)，HER-2高表达阳性率为22.8% (42/ 184)。Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2指标高、低表达的比较见图 1。
2.2 患者临床病理特征及免疫组织化学各指标高、低表达与NMIBC分期、病理分级的关系
单因素分析结果显示，肿瘤直径与NMIBC分期、病理分级呈正相关(P＜0.05)；NMIBC的T1期及病理G3级组织中的Ki-67及HER-2高表达，与NMIBC分期、病理分级呈正相关(P＜0.05)；NMIBC的Ta期及病理G1、G2级组织中的Cyclin D1高表达，与NMIBC分期、病理分级呈负相关(P＜0.05，表 1)。将单因素有意义的指标纳入Logistic回归模型进行多因素分析，结果显示Ki-67高表达、Cyclin D1低表达为NMIBC的T1期独立预测因素(P＜0.01)；Ki-67高表达、HER-2高表达、Cyclin D1低表达为NMIBC的病理G3级独立预测因素(P＜0.01，表 2)。
表 1 184例NMIBC患者临床病理特征及免疫组织化学各指标与肿瘤分期、病理分级的关系
表 2 患者临床病理特征及免疫组织化学各指标与NMIBC分期、病理分级关系的Logistic多因素分析
2.3 免疫组织化学法检测各指标的灵敏度与特异度
免疫组织化学指标Ki-67预测NMIBC分期和病理分级的灵敏度和特异度较Cyclin D1、HER-2高(表 3)。
表 3 免疫组织化学指标预测NMIBC分期、理分级的灵敏度与特异度
3. 讨论
膀胱癌是最常见的泌尿生殖系统肿瘤，首诊患者中约75%被诊断为NMIBC，超过50%NMIBC患者术后2年复发，45%患者进展为MIBC。Holmäng等[5]研究应用欧洲泌尿外科协会指南推荐的EORTC危险评分系统，对NMIBC患者复发进展风险进行评估，其中病理分级按照世界卫生组织(WHO)分级法(1973年)将患者分为低危组、中危组、高危组，精确地制定出治疗方案，而NMIBC的T分期、病理分级是EORTC危险评分系统的两个关键分层指标。研究发现，NMIBC分期、病理分级的一致率仅为50%~60% [6-7]。近年来，膀胱癌的很多分子标志物逐渐被应用于临床，如果可应用这些客观的指标协助判断NMIBC分期、病理分级，则可以帮助临床医生制定下一步治疗方案，从而改善患者预后，避免治疗不足或过度治疗。
Ki-67是一种大分子增殖细胞核蛋白，除G0期外在细胞周期各个阶段均表达，能反映乳腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的细胞增殖活性。Wang等[8]研究了270例NMIBC患者临床病理特征及免疫组织化学指标发现，Ki-67增殖活性与NMIBC患者分期、病理分级呈正相关。此外，Otto等[9]研究结果表明，膀胱癌患者组织中的Ki-67高表达具有较差的无复发生存率(recurrence free survival，RFS)、无进展生存率(progression free survival，PFS)和肿瘤特异性生存率(cancer specific survival，CSS)。对膀胱癌T1期病理G3级的亚组分析结果显示，Ki-67高表达是预测NMIBC进展、复发的独立预测因子[10]。本研究发现Ki-67高表达是NMIBC的T1期和病理G3级的独立预测因素，与上述研究结果基本一致，并且免疫组织化学指标Ki-67在预测NMIBC分期和病理分级中有较高的灵敏度和特异度，因此可应用该指标协助临床医生判断NMIBC分期与病理分级。
HER-2是跨膜酪氨酸激酶受体家族成员之一，HER-2基因扩增与乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌多种恶性肿瘤细胞的生长、侵袭、转移及不良预后密切相关。有研究证实，膀胱癌组织中的HER-2高表达患者的分期和病理分级均较高，预后较差[11]，但也有研究并未发现其相关性[12]。因此，HER-2基因扩增和蛋白高表达在膀胱癌中的意义并不十分明确。本研究结果发现HER-2高表达与NMIBC分期、病理分级相关，是NMIBC病理G3级独立预测因素。一项Meta分析结果显示，HER-2基因扩增与膀胱癌高分级、伴有淋巴结转移相关，其PFS和无病生存率(disease free survival，DFS)均较低[11]。Chen等[13]研究发现HER-2基因扩增与NMIBC病理G3级相关，与本研究结果相似。免疫组织化学检测指标HER-2预测NMIBC分期、病理分级的灵敏度与特异度较Ki-67低。
Cyclin D1是一种常见的细胞周期调节因子。在正常细胞周期中，Cyclin D1与CDK4、CDK6形成复合物，使Rb蛋白磷酸化而失活，从而使细胞周期从G1期进入S期，完成细胞增殖[14]。Cyclin D1高表达能缩短G1期，促使细胞提前进入S期，引起细胞生长失控、转化和癌变。El-Gendi等[15]分析了100例行TURBT的膀胱癌患者的临床病理特征与免疫组织化学指标的相关性，研究结果显示Cyclin D1表达与膀胱癌分期(NMIBC vs. MIBC)、病理分级(low vs. high)均无明显相关性。本研究结果显示，NMIBC的Ta期及病理G1、G2级组织中的Cyclin D1高表达，与肿瘤分期及病理分级呈负相关；Cyclin D1低表达是NMIBC患者T1期及病理G3级的独立预测因素。各研究结果差异的原因，可能由于研究机构采用免疫组织化学染色方法存在差异，以及选取的cut off值未能统一所导致。但免疫组织化学指标Cyclin D1预测NMIBC分期及病理分级的灵敏度与特异度也较Ki-67低。
综上所述，本研究选取的免疫组织化学指标Ki-67的表达水平与NMIBC分期、病理分级呈正相关，是判断NMIBC分期、病理分级的独立预测因素，由于其敏感性及特异性较高、操作方便，对NMIBC分期、病理分级判断较困难的患者具有鉴别意义，适用于临床应用。但本研究属于回顾性分析，在患者选择上可能存在偏倚，样本量较少且为单中心研究，尚需更大样本量的验证。
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