胰腺癌恶性程度极高，5年生存率仅6%，被称为“癌中之王”^[1]。近期肿瘤免疫学领域的进展，对审视胰腺癌恶性行为的内在机制以及寻求新的防控策略提供了新思路。免疫微环境重塑在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用^[2]。特殊的肿瘤微环境为胰腺癌的免疫治疗带来挑战。首先胰腺癌细胞缺乏免疫原性抗原表达，其主要组织相容性抗原（MHC）Ⅰ类分子显著下调；其次具有抗肿瘤作用的效应性T细胞、Th1型、NK细胞、DC细胞以及TAMs（M1）数量减少，活性下降，而调节性T细胞（Tregs）、Th2型、MDSCs以及TAMs（M2）等抑制性免疫细胞聚集^[3]；同时微环境中存在TGF-β1、IL-10、IL-35、CCL5、CXCL12等众多免疫调节因子共同形成胰腺癌免疫抑制的微环境。本文旨在通过综述Treg细胞参与肿瘤免疫微环境重塑的基础转化研究新进展，寻求在肿瘤免疫学水平的胰腺癌诊治新思路，为胰腺癌免疫调节治疗提供新策略。

1.   Treg细胞概述

1.1   Treg细胞定义

Treg细胞是一类可以调节多种免疫细胞功能的T细胞亚群，主要通过抑制T细胞的活化，发挥免疫调节及诱导免疫耐受作用。Treg细胞最初定义基于CD4 ⁺T细胞中IL-2受体α链（CD25）的组成性高表达，后续研究发现也表达细胞毒性T细胞相关抗原4（CTLA-4）以及TNF受体家族相关基因（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR），而转录因子FOXP3基因的表达对Treg细胞的发育成熟以及发挥免疫调节作用至关重要^[4]。

1.2   Treg细胞分类及功能

固有型Treg细胞（natural T regulatory cells，nTreg）起源于胸腺，持续表达FOXP3，主要通过细胞接触作用发挥免疫抑制；诱导型Treg细胞（induced T regulatory cells，iTreg）对T细胞抗原识别受体的刺激高度敏感，继而分泌TGF-β1等细胞因子抑制免疫活性；肿瘤微环境中，固有Treg细胞与诱导型Treg细胞的表型及作用可发生改变并相互转化^[5]。在生理情况下，Treg细胞在保持免疫系统平衡，避免自身免疫性疾病、过敏反应以及移植排斥反应中起到关键的调节作用^[6]。在肿瘤患者中，Treg细胞是参与肿瘤免疫应答抑制的重要成分，可直接抑制CD4⁺T和CD8⁺T细胞、巨噬细胞、NK细胞以及DC细胞的功能，其在瘤体及外周血中的数量呈增多状态且预后不良^[7]，但其增多的机制尚未完全阐明，其参与肿瘤免疫微环境重塑，促进肿瘤细胞免疫逃逸的潜在机制仍有待深入的研究。

2.   Treg细胞与胰腺癌

2.1   Treg细胞分布与胰腺癌患者临床预后的关系

Hiraoka等^[8]首次报道利用免疫组织化学染色技术，在不同级别胰腺导管上皮内瘤变、胰腺导管腺癌组织以及肿瘤引流淋巴结中显示CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺的Treg细胞浸润情况，结果表明胰腺癌局部间质中Treg细胞的数量显著增加，癌前病变演进过程中Treg细胞数量也逐渐增多，并与肿瘤转移、肿瘤分级及临床分期相关。Tang等^[9]研究发现，正常胰腺组织无Treg细胞浸润，而癌组织中浸润的Treg细胞、CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞均显著增加，且癌周Treg细胞浸润更多，浸润Treg细胞与浸润CD4⁺T细胞呈正比，与浸润CD8⁺T细胞呈反比。Liu等^[10]结合临床病理数据研究发现，Treg细胞浸润与胰腺癌肿瘤去分化显著呈相关，但与转移及微血管侵袭无显著相关性，Treg细胞浸润数量可作为判断预后的独立风险因素^[10]。与健康人群相比，胰腺癌患者外周血Treg细胞数量增加，且与TNM分期呈显著相关性，研究表明晚期胰腺癌患者可能与肿瘤远处转移存在密切联系，分层分析在行根治切除手术的胰腺癌患者中，Treg细胞数升高组的生存期缩短^[11]。胰腺癌一线化疗药物吉西他滨可以使患者外周血Treg水平下降，CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127^low Treg细胞的减少提示患者化疗有效，患者生存期也相对较长^[12]。Treg细胞不仅参与胰腺癌发生的各个阶段，促进肿瘤进展，胰腺癌患者肿瘤组织和外周血Treg细胞的升高可以作为不良预后的标记。

2.2   胰腺癌肿瘤微环境中Treg细胞浸润增多的可能机制

2.2.1   外周血中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg细胞向肿瘤局部聚集

Treg细胞可被肿瘤微环境中的细胞因子所趋化。一方面，肿瘤细胞分泌多种细胞因子CCL5、CCL17、CCL22和CXCL9/10/11等，Treg细胞表面存在相关因子受体被趋化招募；另一方面，肿瘤源性血管内皮细胞上的黏附因子可以与Treg细胞上的配体相互作用，使其在肿瘤局部集聚。Tan等^[13]研究发现，CCR5在CD4⁺FOXP3⁺Treg细胞上高表达，动物实验中应用抑制剂阻断CCR5信号，可以减少Treg细胞在胰腺癌肿瘤局部的浸润。本课题组进一步研究发现，肿瘤细胞高表达转录因子FOXP3的胰腺癌患者，肿瘤微环境中浸润的Treg细胞明显高于低表达组，深入研究发现胰腺癌细胞FOXP3可直接转录激活CCL5的表达，胰腺癌细胞通过分泌CCL5招募Treg细胞向肿瘤局部聚集^[14]。此外有研究报道，胰腺癌细胞可诱导微环境中的星形细胞分泌CXCL10，并介导CXCR3+Treg细胞向肿瘤局部募集^[15]。Chen等^[16]通过体内外实验阐述了外周血循环来源的Treg细胞黏附并穿过肿瘤源性血管内皮细胞向肿瘤组织浸润的机制：肿瘤源性内皮细胞高表达黏膜上皮细胞黏附分子-1（MAdCAM-1）、血管细胞黏附-1（VCAM-1）、CD62-E，Treg细胞上特异性表达这些黏附分子的配体β7整合素以及CD62L，黏附分子与其对应配体间的作用介导了Treg细胞的穿血管过程，特异性阻断以上黏附分子可以使Treg细胞对肿瘤源性血管内皮细胞的黏附能力下降，减少肿瘤局部Treg细胞的浸润。

2.2.2   肿瘤微环境诱导产生iTregs

胰腺肿瘤微环境中癌细胞和其他间质细胞分泌的细胞因子如TGF- β1，使CD4 ⁺CD25^-T细胞诱导成CD4 ⁺CD25 ⁺FOXP3 ⁺ Treg细胞^[3]。有研究证明，加入CD3和CD28刺激伴随TGF-β1存在的情况下可体外诱导出Foxp3⁺Treg细胞，同时研究者在Pan02小鼠胰腺癌模型中发现肿瘤细胞通过分泌TGF-β1使得引流淋巴结中的iTregs增加，在Rag-/-小鼠中Pan02组可使CD4⁺CD25^-Foxp3^- Treg诱导为成熟的CD4 ⁺ CD25 ⁺ FOXP3 ⁺ Treg，应用TGF-β中和抗体可阻断这一现象^[17]。

2.2.3   肿瘤微环境固有或招募的Treg细胞的增殖

同样是在Pan02细胞小鼠胰腺原位移植瘤体中，发现浸润了大量的具有效应/记忆表型的Treg细胞，应用特异性TGF-β受体Ⅰ激酶抑制剂和CCR4阻断剂并未完全逆转肿瘤中浸润Treg细胞的数量^[18]，提示该群Treg细胞具有免疫抑制活性和高度增殖活性。肿瘤引流淋巴结中的DC细胞可以通过TGF-β依赖性方式促进Treg细胞的增殖^[19]。另有研究报道Treg细胞上PD-L1的表达也可促进iTreg细胞增殖^[20]。

2.3   Treg细胞通过多种途径参与胰腺癌免疫微环境重塑

Treg细胞不仅可以抑制抗肿瘤免疫的活性，还可通过多种途径协助肿瘤免疫微环境重塑，介导肿瘤细胞免疫逃避、促进肿瘤侵袭转移。

2.3.1   Treg细胞直接发挥免疫微环境重塑作用

Chen等^[21]研究发现，Treg细胞通过分泌抑制性免疫因子TGF-β抑制CD8⁺T细胞的细胞毒作用，介导胰腺癌细胞免疫逃逸。Treg细胞分泌TGF-β同时可以抑制NK细胞功能，降低NK细胞表面NKG2D受体。清除人体以及小鼠Treg细胞可增强NK细胞的增殖、杀伤毒性及其介导的肿瘤识别。Treg细胞通过分泌IL-35减少抗肿瘤效应淋巴细胞在瘤周组织的浸润。本课题组研究发现，肿瘤微环境中的IL-35可以刺激胰腺癌细胞分泌CCL5，进而趋化单核巨噬细胞向肿瘤局部募集，进一步诱导肿瘤新生血管的产生，与肿瘤转移密切相关^[22]，同时还证实胰腺癌特殊的微环境中，肿瘤细胞被赋了类免疫细胞的生物学功能，协同肿瘤局部浸润的Treg细胞、单核巨噬细胞共同发挥免疫抑制功能，并参与促进肿瘤转移的发生^[14]。Treg细胞通过分泌颗粒酶B及穿孔素直接诱导NK细胞和CD8⁺T细胞凋亡。基因工程小鼠体内实验研究发现，相比野生型小鼠，颗粒酶B缺陷荷瘤小鼠反而生存期更长，肿瘤微环境中Treg细胞通过颗粒酶B及穿孔素依赖的方式引起NK细胞和肿瘤相关效应性CD8⁺T细胞的死亡^[23]。

2.3.2   Treg细胞通过与其他免疫调节细胞协同影响免疫微环境重塑

Treg细胞通过直接与APC接触，改变细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）的状态。应用小鼠T细胞过继治疗模型研究发现，Treg细胞可诱导肿瘤浸润T细胞出现耗竭状态，表现为多种效应性细胞因子的失活，同时PD-1、TIM3等共抑制受体的表达增加。深入的机制研究发现，Treg细胞在局部微环境中通过短暂的抗原依赖方式与APC相互作用，形成与CD11c⁺ APCs不稳定的结合，显著抑制APC上的CD80和CD86的表达，进而促进CTL上PD-1及TIM3的表达上调，诱导CTL的功能失调^[24]。类似这一调节过程在DC细胞也被证实，通过阻断Treg细胞上CTLA-4的表达，可逆转DC细胞上CD80和CD86表达下调，进而逆转CTL的耗竭状态。与此同时，肿瘤局部的DC细胞又通过持续表达IL-2，激活Treg细胞，增强其介导的免疫抑制功能^[25]。

总之，Treg细胞通过抑制CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞、NK细胞、B淋巴细胞、树突状细胞及单核-巨噬细胞的分化和功能进而抑制特异性抗肿瘤免疫反应，形成肿瘤免疫抑制微环境，参与肿瘤免疫逃逸。

2.4   靶向肿瘤微环境中Treg细胞-胰腺癌治疗的新策略

靶向Treg细胞的基础与转化研究日益深入，针对Treg细胞在肿瘤患者中的特征，治疗策略之一是减少其浸润的数量，其次则是解除其抑制免疫应答的功能。

2.4.1   应用单克隆抗体抑制Treg细胞免疫调节功能

Treg细胞表面的CTLA-4在其发挥免疫抑制调节过程中发挥重要作用，CTLA-4中和抗体可诱导Treg细胞的凋亡并降低抑制性信号。Ipilimumab（anti-CTLA-4）的Ⅱ期临床试验显示在黑色素瘤中疗效显著，但晚期胰腺癌患者对其无响应^[26]。胰腺癌中应用anti-CTLA-4的其他临床试验如NCT00836407、NCT00112580、NCT 01896869、NCT03104439、NCT02866383、NCT02834013正在招募。利用胰腺癌的动物模型，深入机制研究发现对比常规全身大剂量应用CTLA-4单克隆抗体，癌旁小剂量CTLA-4单克隆抗体可有效减小肿瘤体积，加大剂量后并未增加其抑瘤效果。相反高剂量全身性治疗增加了次级淋巴节Treg细胞的浸润，抵消了CTLA-4单克隆抗体抗肿瘤治疗的作用^[27]。

2.4.2   联合治疗方案抑制Treg细胞浸润数量和免疫调节功能

Aida等^[28]在胰腺癌动物模型中应用IFN- α-腺病毒载体联合anti-GITR单克隆抗体，可使瘤体体积显著缩小。针对GITR的单克隆抗体可以有效抑制Treg细胞功能，增强抗机体肿瘤免疫。IFN-α可通过直接杀伤肿瘤细胞和增强抗肿瘤免疫应答等多种途径发挥作用，联合anti-GITR单抗，可减少肿瘤组织中FOXP3⁺Treg细胞的浸润，同时IFN-α-腺病毒载体可增加肿瘤中CD4⁺T和CD8⁺T细胞的浸润数量。同时该研究提示anti-GITR单抗通过下调Treg细胞上CCR5表达的减少，减少其在肿瘤局部的浸润聚集。研究表明，在动物实验中应用CCR5抑制剂（TAK-779），可显著减少肿瘤组织中Treg细胞的浸润，并抑制肿瘤的增长^[13]。本课题组在前期研究中发现，CCL-5/CCR5信号在胰腺癌肿瘤局部Treg细胞浸润聚集过程中发挥重要作用。本课题组研究发现，胰腺癌细胞高表达转录因子FOXP3转录激活CCL-5表达，参与肿瘤局部Treg细胞的招募富集，使用CCL5单抗可以更加显著地减少Treg细胞浸润，而肿瘤细胞高表达FOXP3亦可作为该中和抗体的优势筛选标记^[14]。

应用联合治疗方案清除肿瘤浸润Treg细胞的临床前研究也是一大热点。IL-2α受体CD25是Treg细胞的一个干预靶点^[29]。Viehl等^[30]应用C57BL/6小鼠皮下胰腺癌模型，对比放射法制备的Pan02全细胞瘤苗治疗组，联合应用CD25单克隆抗体，可有效抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期。在另一项胰腺癌Pan02移植瘤模型实验中，研究者应用胰腺癌细胞特异性抗原免疫激活复合物（ISCOM）疫苗，联合CD25单克隆抗体以及TLR9激动剂CpG，结果发现可显著减少Treg细胞在肿瘤组织的浸润，诱导Th1型免疫应答并激活了免疫细胞，最终通过CD8⁺T细胞发挥抑制肿瘤进展的作用^[31]。在KPC胰腺癌模型鼠中应用，转入野生型Kras（G12D）的李斯特菌疫苗（LM-Kras）联合抗CD25单克隆抗体及环磷酰胺，可抑制癌前病变发生，改善PanIN阶段肿瘤局部的免疫抑制状态，延缓胰腺癌的演进过程^[32]。CD25单克隆抗体联合DC细胞疫苗或DC/TC融合瘤苗诱导NK细胞活性增强，同时给予清除Treg细胞后，淋巴细胞IFN-γ的分泌显著增加，具有明显抑瘤效果效果^[33]。

2.4.3   靶向Treg细胞的临床转化研究

在临床转化方面，应用地尼白介素（denileukin diftitox）联合CEADC疫苗治疗肿瘤患者，清除Treg细胞，显著增强疫苗的抗肿瘤活动。现已被FDA批准在淋巴瘤、白血病和晚期伴有转移的胰腺癌患者中进行临床试验^[34]。Shevchenko等^[18]在Pan02原位成瘤动物模型中，低剂量吉西他滨减少Tregs细胞的聚集，并延长生存。同样Plassmeier等^[35]在胰腺癌基因工程鼠中应用阿司匹林联合吉西他滨可延长生存期，减少Foxp3⁺Treg细胞的数量。在PC患者中以吉西他滨为主的化疗减少外周循环系统中Treg细胞的比例以及绝对数量。在晚期转移性胰腺癌中其他有关Treg细胞的治疗如NCT02947165的Anti-TGF-β临床试验正在招募中。

3.   展望

Treg细胞是肿瘤免疫微环境重塑的重要参与者，其在肿瘤局部的聚集是导致抗肿瘤免疫应答低下的重要原因之一。综述现有研究进展，通过多种途径针对Treg细胞进行干预，减少其在肿瘤局部浸润数量，抑制Treg细胞功能有望增强联合免疫治疗的抗肿瘤效果，为包括胰腺癌在内的多种实体肿瘤免疫调节治疗带来了希望。然而针对Treg细胞的免疫调节治疗需要更加个体化，作为胰腺癌辅助治疗的临床应用仍有待于进一步的探讨。在分子水平上进一步明确Treg与肿瘤免疫微环境重塑的关系，寻找传统治疗与免疫治疗的最佳契合点，将为胰腺癌乃至恶性肿瘤的联合免疫治疗提供实验基础和依据。